乙醇萃取法提取石榴皮單寧以及除藻研究

崔慶飛 劉諾晨 路 歌 高云霞

(河北建筑工程學院 市政與環境工程系，河北 張家口 075000)

0 引 言

藍藻水華是夏季湖泊、水庫等緩流水體最常見的水污染現象之一.由于水體中氮、磷元素的影響，造成了水體浮游藻類的大量生長，嚴重影響了水體的使用性[1-2].研究科學治理水華的工藝迫在眉睫.

除藻的方法大致分為物理除藻、化學除藻、生物控藻三種[3-4].物理除藻包括機械除藻、氣浮除藻、過濾除藻、遮光除藻、超聲波除藻和黏土除藻[5]等；化學除藻包括化學藥劑除藻、絮凝劑除藻和生物化學除藻；生物控藻包括水生生物控藻和微生物控藻.物理、化學法只是應急處理措施，長久使用成本較高，且有二次污染的風險.生物法可以長期有效，但是局限性很大[6].目前，國內外以生物化學法除藻和生物控藻為研究方向[7-8].

生物化學法是從高等植物中提取有效成分，使其作為水處理劑來使用.本實驗采用生物化學的方法，提取單寧的方法有很多，能夠實現工業化大規模的首選溶劑萃取法.選用石榴皮作為實驗材料，用乙醇溶液作為萃取劑，提取其中的單寧酸以及絮凝除藻.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

實驗提取所用的材料石榴皮是安徽亳州的.將收集到的石榴皮曬干，粉碎，過70目的分樣篩，將收集到的粉末用恒溫烘干箱烘干保留.實驗所用的藻類是從中國科學院水生生物研究所選購的藻種編號FACHB-905的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)，該藻種是1998年昆明滇池中分離出來保存的，銅綠微囊藻是夏季藍藻水華典型的優勢藻種.藻種的擴大培養選用的BG11培養基，培養條件參照藻種庫所推薦的：培養溫度25 ℃，光照強度2000 lux 2M，光暗比12 h：12 h.實驗藻種在此條件下培養4～6天，避免培養時間過長出現大量褐色死藻[9].

使用的藥劑有無水乙醇，硫酸亞鐵，磷酸二氫鉀，氫氧化鈉，標準單寧酸，氯化鈉，酒石酸鉀鈉，丙酮，BG11培養液.主要儀器有紫外分光光度計，砂芯抽濾裝置，離心機，生化培養箱等.

1.2 實驗方法

稱取5 g的石榴皮粉末，放入100 mL的萃取劑中.考慮到萃取的影響因素較多，為了實驗方便，采取正交實驗的方法，選取多組具有代表性的實驗組來完成.正交設計表如下：

表1 正交實驗的因素和水平

經萃取后過濾，留存濾液并用同濃度的萃取劑沖洗殘渣補充濾液至100 mL.使用酒石酸亞鐵比色法來檢測萃取的單寧酸含量[10].用提取液按一定比例來做藻類的絮凝實驗.配制酒石酸亞鐵溶液和pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，用于單寧酸量的檢測.將培養的藻類以7000 r/min的轉速離心10 min，將藻細胞用蒸餾水配制成溶液，在紫外分光光度計680 nm處測其吸光度為0.100.加入一定量的提取液于定量的藻溶液中，絮凝沉淀約8 h，測其上清液中葉綠素a的含量來分析去除效果.

1.3 檢測方法

單寧酸的測定用酒石酸亞鐵比色法：繪制標準曲線，不同濃度標準單寧酸溶液分別加入酒石酸亞鐵試劑和pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，混合搖勻呈現紫黑色.測定其吸光度.標準曲線的線性回歸方程為c=0.5219A-0.018 R2=0.9997(c為溶液單寧酸的濃度，A為溶液吸光度).待測樣品的單寧酸含量用上述方法測定.

葉綠素a的測定采用HJ 897-2017分光光度法：將待測樣品用濾膜過濾截留藻類，研磨破碎藻細胞，用丙酮溶液提取葉綠素，3500 r/min離心后分別于750 nm、664 nm、647 nm、和630 nm波長處測定提取液吸光度，待測樣品的葉綠素a濃度根據下列公式計算：

c=11.85×(A664-A750)-1.54×(A647-A750)-0.08×(A630-A750)

式中：c為葉綠素a的濃度(mg/L)，A750、A664、A647、A630分別為檢測樣在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波長處的吸光度.

除藻的效果以葉綠素a的含量來反應，去除率的計算公式為：

(1)

式中：η為單寧酸對銅綠微囊藻的去除率，c為加入單寧酸后葉綠素a的濃度(mg/L)，c0為對照組葉綠素a的濃度(mg/L).

2 實驗結果分析

2.1 單寧酸提取正交實驗

表2 正交實驗設計及結果分析

為保證正交實驗數據的可靠性，正交實驗重復做了四次.從正交表中的極差分析可以看出，三種因素對單寧酸提取的影響主要順序是A>C>B，即乙醇的濃度(%)>萃取溫度(℃)>萃取時間(h).溶劑萃取法提取工藝的最佳組合條件為A2B1C3，即乙醇濃度為50%、萃取時間2 h、萃取溫度60 ℃.該組合在正交表中實驗號4的位置，對比表中其他數據，該種組合下的提取率是最大的，單寧酸含量為19.0%.

2.2 驗證實驗

根據正交表得出的組合再次進行實驗驗證，結合之前的四次實驗的四組數據分析

表3 實驗最佳組合數據分析

根據四次正交實驗的數據和驗證實驗共五組數據分析結果如表3所示，最佳組合條件下，乙醇溶劑萃取法所提取的單寧酸含量為18.96%、19.12%、19.07%、18.84%、19.04%，平均提取率為19.01%.實驗分析SD=0.098，RSD%=0.52%(N=5).由此數據可看出，相同條件下每次提取所得的含量波動不大，實驗結果準確.正交實驗結果準確可靠.

對比H.-Q.Wang等學者[11]研究的丙酮萃取法提取石榴皮中的單寧酸含量為22.2%，乙醇萃取法的萃取效果欠佳.以丙酮和乙醇為萃取劑以最佳條件多次提取單寧酸[12]：(丙酮萃取條件為丙酮濃度為70%，萃取時間為3 h，萃取溫度設置為60 ℃).

表4 石榴皮單寧含量

由表4可以看出該種石榴皮中單寧酸的含量約為25.45%～26.58%左右.

2.3 除藻實驗

除藻實驗所用的單寧酸溶液來源于驗證實驗中的第五組，單寧酸含量19.04%，萃取液濃度為9.52 g/L.同時用化學試劑標準單寧酸來配制相同濃度的對照液來進行除藻實驗的研究.

取在吸光度在680 nm處為0.100的藻液49 mL放置于小燒杯中，將單寧酸萃取液和標準液按照倍數稀釋成0.2 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L的工作液，分別取1 mL加入燒杯中混勻靜置，實驗設置三組平行組，時間為8 h左右，測其上清液中的葉綠素a的濃度，計算其去除率.

圖1 不同投加量下的除藻效果對比

從圖1中可看出，單寧酸萃取液的投加量在4 mg時去除率已經達到98.52%，相同投加量下的單寧酸標準液去除率為96.49%，已經達到去除效果.石榴皮單寧酸萃取液和單寧酸標準液在去除率趨勢上是一致的，實驗發現萃取液的去除率都略微優于標準液，可能是在萃取過程中溶入了石榴皮中的其它活性成分，對藻類同樣有絮凝沉淀的作用，而兩種工作液的去除率區別不大，可能是其它活性成分的作用效果不佳或者是成分含量極少的緣故，例如多糖、多酚、酮類等[13].

3 結 論

(1)通過正交實驗的結果可知，乙醇溶液萃取石榴皮單寧酸的影響因素程度大小為濃度>溫度>時間，該方法下的最佳萃取條件為乙醇濃度為50%、萃取時間2 h、萃取溫度60 ℃；該條件下的萃取含量約為19.0%.

(2)驗證實驗分析結果為該工藝的平均提取率為19.01%.實驗分析SD=0.098，RSD%=0.52%(N=5).經多次重復提取，實驗材料所用的石榴皮單寧酸含量在25.45%～26.58%左右.

(3)根據除藻實驗的數據分析，濃度為4 g/L的單寧酸萃取液1 mL可以作用于50 mL的藻類水樣，去除率為98.52%.標準單寧酸4 mg可以作用于50 mL的藻類水樣，去除率為96.49%.

4 展 望

含有單寧酸的大多為樹皮和果實的外皮[14-15]，原料廉價易得.植物單寧除了可以作為絮凝劑之外，還可以做阻垢劑、抗氧化劑、抑菌劑等等[16].

單寧酸易溶于丙酮、乙醇和乙酸乙酯等有機溶劑中，對比這幾種常見的有機溶劑可發現，在價格方面乙酸乙酯>乙醇>丙酮，萃取效率乙酸乙酯>丙酮>乙醇[17]，萃取劑損失率乙醇>乙酸乙酯>丙酮，循環回收率乙醇>丙酮>乙酸乙酯.綜合上述因素分析，價格方面乙酸乙酯的使用成本是丙酮的兩倍左右，雖然萃取效率最高，但是應用于工業化并不合適，并且萃取的效果與其他兩個萃取劑相差不是太多；而考慮到萃取到的單寧酸將作為絮凝劑來使用，并不提倡具有毒性的丙酮來提取，同時相同條件下，乙醇作為萃取劑，蒸發損失率最低，且易于回收重復利用，是工業化提取植物單寧酸的首選萃取劑.