食品中致敏蛋白的檢測技術研究進展

王世鵬

（黑龍江省標檢產品檢測有限公司，黑龍江哈爾濱 150000）

食物過敏也稱為消化系統變態反應或食物變態反應等，是指利用所攝入食物的某種組成成分作為抗原，將其與機體中相應抗體發生免疫應答而產生的一種變態反應疾病。如今，食物過敏已成為全球公共衛生問題，是全球第六大疾病。據統計，全球食物過敏案例明顯增加，英國有7%兒童食物過敏，澳大利亞有9%，而我國兒童食物過敏患病率高達6.2%，這比一般疾病的患病率要高很多。而在世界變態反應組織報告中顯示，過敏現象困擾了全世界30%～40%的人口。此外，相關研究表明食物過敏能夠對不同的人群產生相應的負面影響，并且與焦慮癥的增加有緊密關系[1]，因此食物過敏嚴重影響人們的日常生活和身體健康。

為降低食物過敏的風險，保障消費者的安全，歐盟、美國、加拿大、日本等多個國家已經發布了相關條例，要求在食品標簽中標明食物的致敏原和含量[2]，我國發布GB 7718—2011《預包裝食品標簽通則》、GB/T 237792—2009《預包裝食品中的致敏原成分》等法規中也明確規定要在相應的包裝標簽上注明致敏物[3]，為消費者提供一定的食用安全保障，即使能在一定程度上降低食物中毒的幾率，但依然存在很大的風險。此外，據調查結果表明食物中的主要致敏物質是蛋白質。因此，針對食物中的致敏蛋白能夠進行準確、有效的檢測可以減少食物過敏現象，對于消費者的健康提供了有效保護。對當前食品中致敏蛋白的快速檢測技術進行調研也變得非常有意義。

1 食品中致敏蛋白概述

食品中主要的致敏原是蛋白質，一般為相對分子質量10～70 kD的蛋白質或糖蛋白。根據引起的過敏反應的臨床特點和速度不同，可以將過敏反應分為4類：I型過敏反應，即速發型過敏反應；II型過敏反應，又稱細胞毒性型過敏反應；III型過敏反應，即免疫復合物型過敏反應；IV型過敏反應，也就是遲發型過敏反應。根據抗體種類的不同又可將介導分為2種類型：由抗體蛋白IgE介導型、由非抗體蛋白IgE介導型。其中，最常見的食物致敏反應屬于IgE介導型[4]。IgE介導型的過敏機理是指過敏抗原通過機體的誘導進入體內，促進體內IgE的生成，繼而IgE結合到肥大細胞和嗜堿性粒細胞，使機體進入對該過敏原特異致敏狀態，當過敏原再次接觸時，與細胞膜上的IgE受體結合引起一系列生化反應，繼而釋放出諸如組織胺等各種與過敏反應和炎癥有關的生物活性介質。由此可見，特異性IgE對于致敏蛋白的致敏作用有著很大的影響，兩者的結合是導致致敏蛋白發揮致敏性的主要環節。因此，通過檢測特異性的IgE表達量，能夠反映出致敏抗原的情況，從而對檢測致敏蛋白有著重要的指導意義。

2 食品中致敏蛋白的檢測技術進展

由于食物致敏作用對于人的健康有著嚴重的威脅，因此食品中致敏蛋白的檢測技術有著重要的研究價值和意義。當前用于檢測致敏蛋白的技術根據檢測部位的不同分為體內檢測和體外檢測2種。體內檢測是利用動物模型、人體皮膚或者雙盲安慰劑對照食物激發試驗進行定量或半定量地對食物致敏原的過敏活性進行檢測，但具有一定的風險率，因此限制了檢測方法的應用范圍[5]。體外檢測技術主要分為直接檢測致敏蛋白質的方法和針對蛋白質中基因檢測方法。基于致敏蛋白的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法、電泳法、高效液相色譜與質譜分析法等。

2.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是現在檢測致敏蛋白普遍使用的一種方法，其原理通過一種用酶標記的抗體和相應的致敏蛋白進行免疫反應，利用蛋白酶作為指示劑，使蛋白酶作用后底物的顯色深淺來反應被測食品中抗原或抗體的含量，一般多采用雙抗體夾心法，即選用固相載體上的抗體將和相應的致敏蛋白結合，形成抗原抗體復合物，然后將帶有酶標記的另一種抗體和抗原抗體復合物相結合，使之發生顯色反應，顏色越深抗原吸附在固相載體的量越多[5]。雙抗體夾心ELISA法能夠提高測定的靈敏度、準確性和檢測速度，此外還有間接法、競爭法等。李曉燕等人[6]通過建立雙抗體ELISA法測定蝦中的致敏蛋白，得到了蝦中致敏蛋白的檢出最低限為40 ng/mL，在40～1 000 ng/mL的范圍內線性良好。

2.2 電泳法

電泳法是指利用待測溶液中被測蛋白的質量和所帶電荷的不同，在外加電場的作用下能夠在惰性介質中形成狹窄的區帶，所形成的區帶在紫外光下能夠準確測定分子量、等電點、純度等參數，從而能夠得到所測致敏蛋白的含量。電泳法主要有經典電泳法、免疫親和毛細管電泳法、區帶毛細管電泳法以及凝膠毛細管電泳法等。經典電泳法效率低、耗時長、且商業化的試劑盒不夠成熟，因此經典電泳法并不廣泛用于致敏蛋白的測定。田蘭等人[7]利用聚乙烯醇涂層毛細管，在紫外檢測214 nm，分離電壓20 kV條件下對乳及乳制品中的α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg） 等5種蛋白進行分離測定。結果顯示，蛋白線性良好，測定的鮮奶中α-乳白蛋白（α-La） 含量為0.93 mg/mL，β-乳球蛋白 （β-Lg） 含量 2.67 mg/mL，α-酪蛋白 （α-CN） 14.32 mg/mL，β-酪蛋白 （β-CN） 4.12 mg/mL而k-酪蛋白（k-CN） 9.36 mg/mL。5種蛋白線性良好，線性相關系數均大于0.997 8。

2.3 高效液相色譜與質譜分析法

高效液相色譜與質譜分析法（LC-MS/MS） 是將色譜的分離能力和質譜的定性能力結合起來，能夠全面有效地對多種致敏蛋白進行定量和定性分析，并且操作簡便易行。洪宇偉等人[8]通過建立LCMS/MS定量檢測方法來測定烘培食品中花生過敏原Ara h2的含量，結果表明花生樣品中致敏蛋白Ara h2的定量限達4.45 μg/g，可回收率在106.0%～107.8%。李麗芳等人[9]在原有LC-MS/MS的基礎上進行了改進，利用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLCMS/MS）檢測大豆中主要的致敏蛋白，最終成功篩選到可用于表征11種大豆主要過敏原（大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亞基，β-伴大豆球蛋白的α"、α和β亞基，P34，P28及KTI）的特征肽段共29條，相較于原有的LC-MS/MS檢測分析法的，UPLC-MS/MS檢測目標更廣泛，檢測結果能更全面、準確的顯示出致敏蛋白的種類。

2.4 實時熒光聚合酶鏈式反應法

實時性聚合酶鏈反應是基于基因水平上對致敏蛋白進行檢測的一種方式，即定量測定樣品中特定DNA序列的聚合酶鏈反應。利用熒光實時聚合酶鏈式反應方法檢測食品中Ara h1基因成分，從而推斷食品中是否含有花生過敏主要過敏原成分。結果顯示，標準曲線在3×102～3×108copies的范圍內線性良好，檢測低限設定為3×103copies。目前實時熒光聚合酶鏈式反應測定技術可以對食品中的致敏蛋白進行定量定性檢測，能夠針對特定食品中致敏蛋白的DNA進行檢測，靈敏度高，準確性好。

3 結語

隨著社會經濟的發展和國際食品安全水平的提高，引起人們對于食物致敏等問題的高度重視，對于食品的安全性也有了更高的警惕性，因此保障食品安全，保證消費者的食用健康是當前研究的熱點課題。建立食品中致敏蛋白的檢測技術，能夠較大程度的減少食物過敏情況的發生，具有重要的研究價值和意義。介紹了幾種主要的食品中致敏蛋白的檢測方法，但各類方法都存在相應的限制性和缺陷，因此需要對當前的檢測技術進一步優化和改善，從而提高食品的安全性。如今基因水平的檢測方法是食品檢測領域中的一個重要發展方向，能夠定量定性地檢測食品中的致敏蛋白成分。因此，將一些新型標記材料運用于基因水平的檢測技術，能夠提高檢測的效率和準確性，對于食品中致敏蛋白的檢測具有深遠意義。