膀胱癌組織中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p的表達變化及其意義

周文鈞，黃國華，應巧，牟健

廣安市人民醫院，四川廣安 638000

膀胱癌(BC)是起源于尿路上皮的惡性腫瘤，病理類型以膀胱移行細胞癌最為常見。世界范圍內，每年新發病患者例數約40萬例，近年隨著我國人口的老齡化，BC的發病率及病死率逐漸上升[1]。BC的臨床治療方法包括手術、化療及卡介苗生物治療等，但因惡性程度高，即使經積極治療仍可出現復發及轉移，甚至危及患者生命[2]。非編碼RNA(ncRNA)細胞內重要的RNA調控分子，包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)等，能夠調控靶基因的轉錄、翻譯及翻譯后修飾，影響靶基因表達，不僅參與正常細胞的發育分化等生理學過程，還參與免疫、炎癥及腫瘤等疾病的發生發展[3]。lncRNA MALAT1編碼基因位于11q13.1，可充當核糖核蛋白復合物的分子支架發揮生物學功能[4]。lncRNA MALAT1在腎癌[5]、肝細胞肝癌[6]等腫瘤中存在異常過表達的現象，并能作為細胞遷移相關基因、周期調控相關基因的轉錄調控因子，促進腫瘤的增殖及轉移。miR-146b-5p基因位于10q24.32，能夠參與形成RNA誘導的沉默復合物，可通過堿基配對的方式識別結合下游靶基因mRNA，導致靶基因mRNA的不穩定。研究[7-8]發現，miR-146b-5p在胃癌、甲狀腺癌等腫瘤中表達水平降低，其功能喪失能增加腫瘤細胞增殖、侵襲能力促進癌癥進展。2015年7月～2020年6月，我們觀察了BC組織中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年7月～2020年6月廣安市人民醫院收治的BC患者149例，男91例，女58例；年齡25～88(45.3±8.5)歲。納入標準：①患者均為首次發現；②病理學檢查確診為BC；③以往未接受放化療及靶向治療等抗腫瘤治療。排除標準：①同時伴有間質性膀胱炎、神經源性膀胱等疾病；②伴嚴重泌尿系統感染；③合并自身免疫性疾病或精神障礙性疾病。腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期105例，Ⅲ～Ⅳ期44例；病理分級：高分化59例，中低分化90例；病理類型：移行細胞癌129例，非移行細胞癌20例(鱗癌14例、腺癌6例)；腫瘤直徑≤3 cm 100例，>3 cm 49例；有淋巴結轉移68例，無淋巴結轉移81例。手術留取BC患者新鮮腫瘤組織及癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣2 cm以上)各5 mg。本研究經本院倫理委員會審核通過，且所有患者對本研究知情同意并簽字。

1.2 BC組織lncRNA MALAT1、miR-146b-5p檢測方法 采用熒光實時定量PCR法。TRIzol法提取組織中總RNA，分光光度計檢測組織中總RNA的濃度和純度，OD260/OD280在1.8～2.1。以總RNA為模板，反轉錄合成cDNA。進行熒光定量PCR反應。反應條件：94 ℃、30 s，65 ℃、30 s，70 ℃、10 min，共35個循環。反應體系：2×SYBR Green remix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL和ddH2O 7 μL。以U6為內參，U6正向引物序列：5′-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；lncRNA MALAT1正向引物序列：5′-AGATTCCGTAACTTTA-3′，反向引物5′-AACACGTCTATACGC-3′；miR-146b-5p正向引物序列：5′-ATGCGCGCTGAGAACTGAATT-3′，反向引物5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以2-△Ct表示lncRNA MALAT1、miR-146b-5p的相對表達量。

2 結果

2.1 BC及癌旁組織中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p相對表達量比較 BC及癌旁組織中lncRNA MALAT1相對表達量分別為2.154±0.413、0.636±0.201，miR-146b-5p相對表達量0.509±0.122、1.255±0.360，兩者比較，P均<0.05。

2.2 lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表達與BC臨床病理特征的關系 結果見表1，由表1可知，lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表達均與BC淋巴結轉移有關(P<0.05)。

表1 lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表達與BC臨床病理特征的關系

2.3 BC組織中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表達的相關性 BC癌組織中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表達呈負相關性(r=-0.711，P<0.05)。

3 討論

BC是泌尿外科常見的惡性腫瘤，全球每年死亡例數約20萬例[9]。根據組織起源的不同，BC可分為尿路上皮癌、鱗癌及腺癌等，其中以尿路上皮癌最為常見。多種因素參與促進BC的發生過程，如遺傳、環境及吸煙等因素均與BC的發生有關，特別是存在于煙草、化工原料等成分中化學致癌物，如芳香胺類化合物，能夠激活HER-2、H-ras等原癌基因的表達，誘導膀胱上皮細胞發生惡變，引起腫瘤細胞生長失控[10]。此外，BC發生時涉及c-myc、c-fos等癌基因的過度激活及p53、PTEN等抑癌基因的失活，因此深入研究BC發生發展的分子機制，對于臨床上尋找新的診斷治療靶點具有重要臨床價值。

lncRNA是長度200～300個核苷酸的分子，最初被認為是轉錄噪聲，但隨后研究表明其在腫瘤發生、轉移和耐藥性的形成等過程中發揮重要的生物學功能[11]。lncRNA MALAT1是一種普遍表達且高度保守的lncRNA，已被證明在肺癌、肝癌等人類惡性腫瘤中存在過表達現象，其能夠作為分子海綿結合并抑制miR-375功能，進而促進下游癌基因YES相關蛋白1表達，導致腫瘤細胞的無限增殖及浸潤轉移，并且lncRNA MALAT1的高表達與腫瘤患者的不良生存預后有關，有可能是新的腫瘤診斷、治療靶點[5,6,12]。本研究顯示，BC組織中lncRNA MALAT1相對表達量明顯高于癌旁組織，表明lncRNA MALAT1可能作為一種癌基因參與BC的發生發展。但lncRNA MALAT1表達升高的機制目前尚不明確，有研究報道腫瘤發生時細胞內存在內質網應激(ER)的現象，導致轉錄因子內質網細胞核信號1的表達，激活ER激酶信號通路，促進MALAT1的表達[13-14]。本研究還顯示，lncRNA MALAT1表達與BC淋巴結轉移有關，表明lncRNA MALAT1的高表達可能參與促進BC的淋巴轉移。分析其原因，lncRNA MALAT1可以作為分子海綿結合miR-101-3p，促進血管內皮生長因子C(VEGF-C)的表達，而VEGF-C能夠促進腫瘤的淋巴管生成，導致淋巴結轉移[15-16]。lncRNA MALAT1還能夠抑制β-連環蛋白的表達，導致Wnt信號通路的活化，促進Vimentin等間質性標志表達，使腫瘤細胞向局部浸潤，侵犯淋巴管，導致淋巴轉移[17]。

miRNA長度為19～22個核苷酸，其通過與靶基因mRNA的3′-非編碼區(UTR)結合降低mRNA的穩定性，下調靶基因的表達。研究[18]發現，miRNA在心血管疾病、免疫性疾病及惡性腫瘤等疾病中均發揮重要的生物學調控功能，并影響疾病的發生發展。此外，不同腫瘤中及同一腫瘤中均存在多種miRNA的異常表達，形成調控腫瘤細胞生物學行為的復雜的網絡，而檢測腫瘤中miRNA的表達有可能成為腫瘤診斷及治療的分子靶點[19]。miR-146b-5p基因位于人類10號染色體。研究[20]表明，胃癌組織中miR-146b-5p的異常表達降低能夠促進腫瘤的增殖及遷移等生物學行為，是預測患者預后的獨立危險因素。本研究顯示，BC組織中miR-146b-5p表達明顯低于癌旁組織，表明miR-146b-5p在BC中可能發揮腫瘤抑制的生物學功能，機制可能與lncRNA對miR-146b-5p的表達調控有關。雙熒光素酶實驗發現，lnc-AL445665.1能夠直接結合miR-146b-5p的啟動子區，抑制miR-146b-5p的表達，促進平滑肌瘤細胞增殖[21]。本研究還發現，miR-146b-5p的表達與BC淋巴結轉移有關，提示miR-146b-5p低表達促進BC的淋巴結轉移，其機制可能是miR-146b-5p通過抑制SWI/SNF相關蛋白5的表達，進而抑制轉化生長因子β(TGF-β)信號通路的活化，而腫瘤發生時miR-146b-5p的低表達導致TGF-β通路的過度活化，促進腫瘤細胞的淋巴轉移。本研究顯示，BC癌組織中lncRNA MALAT1與miR-146b-5p表達呈負相關，機制可能是miR-146b-5p對lncRNA MALAT1表達存在負調控作用。

總之，BC組織中lncRNA MALAT1表達明顯上調，而miR-146b-5p表達明顯下調，兩者均與BC患者淋巴結轉移有關，有希望成為新的診斷和治療BC的分子標志物。