豫皖小麥田麥根腐平臍蠕孢交配型基因檢測

李光宇，李田田，李洪連，臧 睿，徐 超，耿月華，張 猛

(河南農業大學植物保護學院，河南鄭州 450000)

麥根腐平臍蠕孢[Bipolarissorokiniana(Sacc.) Shoemaker]是一種可以引起禾谷類植物根腐病、葉斑病、斑枯病和籽粒黑點等病害的病原真菌[1-3]，其分布于世界上很多國家[4-5]。近年來，由于秸稈還田措施的實施、耕作制度的改變以及氣候的變化[6]，小麥根腐病的發生在中國不斷加重，尤其在黃淮地區，已經成為了小麥生產上的重要問題[7]。麥根腐平臍蠕孢在小麥的整個生育期內均可侵染小麥導致病害，該菌在田間主要以菌絲體或分生孢子存活于帶菌種子、土壤或病殘體組織，其中分生孢子在病害侵染循環中起著重要作用[8]。在自然條件下，麥根腐平臍蠕孢主要以無性態分生孢子侵染為害。

研究證實，子囊菌交配型基因(mating type gene, MAT)具有一定的廣泛性，其編碼的產物是調控子囊菌有性生殖的重要轉錄因子[9]。子囊菌交配型基因對真菌的生殖基因表達與調控具有重要意義。同宗配合子囊菌通常觸及單個遺傳座位，交配型基因的編碼產物具備轉錄因子的功效，主要調控真菌有性生殖相關的一系列生命過程。然而，對異宗配合子囊菌的有性階段研究更具挑戰性，旋孢腔菌屬(Cochliobolus)的大多數物種為異宗配合型。文景芝和陸家云[10]對中國17種植物上的B.sorokiniana進行了有性孢子誘導試驗，發現子囊孢子的產生受培養基、溫度、pH值的影響。Zhong和 Brian[11]對麥根腐平臍蠕孢的交配型基因開展了詳細的研究，發現C.sativus有兩個交配型基因，分別為MAT-1(2 681 bp)及MAT-2(2 547 bp)；將其與近似種B.maydis進行同源比對并設計了針對B.sorokiniana的MAT-2基因HMG(high mobility group domain)的特異性引物，可特異性的擴增270 bp的HMG片段。絕大多數半知菌的有性態屬于子囊菌門，尋找半知菌所對應的有性態一直是真菌學研究的熱點。本研究擬對中國河南、安徽兩省小麥田分離到的33株麥根腐平臍蠕孢群體進行MAT基因型探索，為該菌的遺傳學研究及病害生態防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株獲取

于2017-2019年在河南、安徽不同地區于小麥揚花期采集小麥根部土壤(2～5 cm土層)及病葉標本。土壤采集參考翟妮平[12]方法。土壤樣本采用稀釋平板法[13]、病葉通過組織分離方法[14]獲得目的菌株，分別挑取單個分生孢子進行純化，共獲得麥根腐平臍蠕孢菌33株。

1.2 HMG片段的檢測

DNA提取：利用無菌打孔器(直徑5 mm)將分離菌株的單孢純培養物制成菌餅，放入PD(potato dextrose)液體培養基中，于25 ℃下震蕩(140 r·min-1)培養5 d；收集菌絲，加入液氮進行冷凍干燥并磨碎，參照Zhong[15]的方法提取病菌基因組DNA。用Zhong[11]設計的引物CsPrimer1(5′-AAGGCTCCCCGCCCGATGAAC-3′；5′-CTCGGCGTGTACTTGTAGTTGGG-3′)和方法進行PCR擴增，DNA模板濃度為5 ng·μL-1。取5.0 μL的擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，有擴增條帶的為MAT-2基因，未擴增出條帶的為MAT-1基因。

1.3 形態學觀察和致病性測定

對分離獲得的33株麥根腐平臍蠕孢菌株參照Leng[16]的方法進行菌落形態觀察、顯微形態特征觀察，于產孢旺盛期制玻片、拍照，記錄產孢結構特征、孢子形態及大小，并進行致病性測定。

1.4 構建系統發育樹

通過同源比對的方式在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的數據庫里選取含有MAT-2基因的子囊菌不同類群69個菌株，進行MAT-2蛋白質的氨基酸序列分析，用貝葉斯法構建MAT-2基因的系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

對33株麥根腐平臍蠕孢菌進行MAT基因PCR擴增發現，有21株檢測出目的條帶(圖1)，大小一致，均為270 bp左右，其中來自河南的有L1、L2、L3、L6b、L6w、L8、L11、L12、L13、L14、L17、L18、L19b、L19w、14，來自安徽的有1、2、3、4、6、15，均為MAT-2型菌株。其余12株無目的條帶，為MAT-1基因型菌株。群體基因型MAT-2∶MAT-1為7∶4。

2.2 菌落形態

挑選MAT-1基因型菌株(L4、L15、L16)和MAT-2基因型菌株(L1、L2、L6b)，在PDA平板上培養7 d后觀察其菌落形態(圖2)。發現菌落早期呈絨毛狀，稀疏，培養7 d后變成黑色或暗褐色，背面褐色。生長較快，25 ℃下，7 d滿皿，菌落直徑達9 cm，呈輪紋狀，其中L6b最明顯。

表1 33個麥根腐平臍蠕孢菌株的采集信息Table 1 Sampling sites of the 33 Bipolaris sorokiniana strains

A(從左向右)： DL2000 marker、L1、L2、L3、L4、L6b、L6w、L8、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17、L18、L19b、L19w、1、2、3、4、5、6、7；B(從左向右)： DL2000 marker、8、9、11、12、14、15、16、17、21。

2.3 孢子形態

菌株L1和L2攜帶有MAT-2基因，菌株L4和L15攜帶有MAT-1基因。菌株L1和L2的分生孢子呈橢圓形，略彎(圖3)，菌株L4和L15的分生孢子呈梭形，均為暗橄欖褐色，所有菌株孢子長度為60～80 μm(圖3)。各菌株的菌絲多表生，褐色，寬度為2.5～4.0 μm(圖4)。大多分生孢子梗單生，褐色。分生孢子棍棒形或長橢圓形，黃褐色至深褐色，多直，有時彎，基部細胞近臍點處顏色較淺，5～8(多為7個)個假隔膜，54.0～84.5 μm × 18.5～25.5 μm，av：67.5 μm× 22.0 μm。

2.4 致病性

將直徑為5 mm的菌餅接種到小麥葉片上，發現L1、L2、L6b(MAT-1基因型菌株)和L4、L15、L16(MAT-2基因型菌株)在小麥的接種部位均產生明顯的灰褐色病斑，說明MAT-1或MAT-2交配基因型菌株均有強的致病性，二者在葉片上的擴展程度無明顯差別，均是先引起葉片失綠變黃，然后出現壞死病斑，潮濕環境下病斑周邊長出白色菌絲(圖5)。

圖3 4株麥根腐平臍蠕孢菌孢子形態Fig.3 Morphological observation of the conidia from the four strains of Bipolaris sorokiniana

圖4 4株麥根腐平臍蠕孢菌絲的形態Fig.4 Morphological observation of the hyphae from the four strains of Bipolaris sorokiniana

圖5 6株麥根腐平臍蠕孢菌株接種矮抗58葉片5 d的發病情況Fig.5 Aikang 58 leaves inoculated with the six strains of Bipolaris sorokiniana after 5 d

2.5 系統發育樹的分析

用貝葉斯法構建了69株子囊菌的MAT-2基因型的系統發育樹(圖6)，外群選擇Saccharomy cescerevisiae(登錄號：CAA45335)。進化樹顯示，具有MAT-2基因型的子囊菌被分為6個亞組，分別為盤菌亞門Pezizomycotina的糞殼菌綱Sordariomycetes、散囊菌綱Eurotiomycetes、座囊菌綱Dothideomycetes、茶漬綱Lecanoromycetes、錘舌菌綱Leotiomycetes和酵母菌亞門Saccharomycotina的酵母綱 Saccharomycetes。該進化樹與王雪亮等[17]MAT-1基因的拓撲結構非常類似，與所選物種的分類進化關系很接近。典型的以瓶體產孢方式的青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)聚類在進化樹的端部。而B.sorokiniana與孔生式產孢的Alternaria、Stemphylium、Ulocladium、Curvlaria等屬的菌株聚類在一個亞組，與分類學的結果相一致。整體分析結果與物種的分子系統學表現出來的親緣關系基本一致。

3 討 論

絲孢真菌的有性態是真菌學研究的一個熱點，大多數菌有性態為MAT基因交配型， MAT 基因的進化與物種進化一致。本研究中，MAT-1和MAT-2型菌株的菌落形態、菌絲生長速度、孢子形態和致病性均無明顯差異。麥根腐平臍蠕孢菌的無性繁殖產孢方式與Bipolarismaydis的非常近似。Turgeon[18]對B.maydis的有性態的研究表明，兩種不同交配型菌株能夠穩定的產生子囊孢子，但是文景芝[10]發現，麥根腐平臍蠕孢菌即使存在兩種交配型的孢子，也未必可以產生有成熟子囊孢子的子囊殼。本研究發現，河南、安徽小麥田的B.sorokiniana群體存在兩種交配型的菌株，但是目前還未在自然條件下發現其有性態。鑒于此，今后應從兩個方面開展下一步研究，一是在大田尋找麥根腐平臍蠕孢菌的有性態；二是在室內用兩種交配型菌株進行有性態的誘導，以探索異宗配合的子囊菌的有性孢子產生機制。

圖6 貝葉斯法構建的69株 MAT-2交配型子囊菌系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of MAT-2 mating genes in 69 ascomyces constructed by bayesian method

麥根腐平臍蠕孢菌是在世界范圍內影響小麥生產的一種重要病原菌。子囊菌交配型基因MAT是調控子囊菌有性生殖的重要的轉錄因子。本研究發現，在河南、安徽地區的麥根腐平臍蠕孢中存在MAT-1和MAT-2兩種交配型基因，并且兩種交配型菌株在其生物學性狀和致病性上無明顯差異。本研究結果有助于深入開展麥根腐平臍蠕孢菌的有性生殖的研究和應用，并且為其他的子囊菌交配型基因的研究提供的理論依據。