不同乙醇置換處理對小麥小孢子和花粉育性檢測的影響

劉海英，甄俊琦，茹振鋼，張亞娟，馮必得，景秀秀，王 瑩

(1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉 453007；2.河南科技學院小麥中心，河南新鄉 453003)

小麥是中國重要的糧食作物之一，小麥生產對保障國家糧食安全具有重要意義[1]。雜種優勢利用是提高小麥產量和品質的有效途徑[2]。BS系列、CS系列、ES系列的育成，使我國在二系法雜交小麥研究和應用領域居于世界領先水平[3-6]。小麥溫敏雄性不育系BNS366由河南科技學院育成，抽穗前日平均溫度低于8.9 ℃時徹底不育[7]，在小麥雜交制種中的應用逐漸擴大，以其近等基因系鄭麥366為對照構建試驗模型，揭示其花粉敗育機理具有重要的理論意義。開展小孢子發育過程的細胞學觀察和花粉育性檢測，是進一步開展相關研究的基礎。

前人對小麥小孢子發育和育性檢測開展了廣泛研究，常用I2-KI法觀察小孢子內的淀粉積累情況[7-10]，用DAPI染色法觀察細胞核情況[10-12]。本課題組前期研究發現，FAA固定一段時間后，采用I2-KI法可以清晰顯示小孢子內淀粉積累情況，采用DAPI法染色時小麥三核期小孢子細胞質呈白色渾濁狀，細胞核模糊，且FAA對操作人員會造成化學燒傷，敏感人群易引起頭面部皮膚過敏或潰爛等傷害，不利于大量開展細胞學研究(內部資料未發表)。已有研究發現，FAA固定液固定小麥穗24 h后，采用90%-80%-70%-70%梯度置換固定液(每次置換時間均為30 min)，最后轉入70%乙醇中保持備用，再經I2-KI法和DAPI法染色均可以取得良好的細胞學觀察效果[13]，但需要消耗大量乙醇，且操作時間長。前人有關小孢子細胞學觀察的研究中，采用FAA固定后，進行乙醇置換的處理各有不同，其對細胞圖像的清晰度影響是否存在差異尚未見報道。

為此，本試驗以鄭麥366和BNS366為試驗材料，用 FAA固定液固定小麥穗后，進行3種乙醇置換處理，對比I2-KI法和DAPI法染色效果，并將其與花粉育性統計結果進行比較，以明確小麥小孢子發育細胞學觀察和花粉育性檢測的適宜乙醇置換處理。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗材料種植于河南師范大學小麥試驗田，屬黃淮麥區(東經113°54′，北緯35°19′，海拔 76.3 m)，暖溫帶大陸性氣候。

1.2 試驗材料與設計

以溫敏小麥雄性不育系BNS366及其近等基因系鄭麥366為供試材料，均由河南科技學院小麥中心提供。所有材料于2018年10月10日正常秋播，按一般大田管理方式栽培，次年選代表型植株主莖穗進行研究。

試驗以FAA(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林= 18∶1∶1)為固定液。參照劉海英等[14]的農藝特征判斷標準，配合醋酸洋紅染色鏡檢結果，確定取樣時期，于小孢子發育的單核期、二核期、三核期和開花期，上午9:00-10:00，各選取10穗代表型植株主莖穗，剪去頂部與基部各6個小穗，置于FAA固定液中，0.034×105Pa抽真空30 min后在4 ℃條件下固定24 h，然后采取不同乙醇置換處理進行后續處理，具體如下：

90%-80%-70%：移除FAA，按順序經過90%和80%乙醇梯度置換各30 min，最后轉入70%乙醇中，在4 ℃冰箱中保存備用；

70%-70%：移除FAA，用70%乙醇置換30 min后，轉入70%乙醇中在4 ℃冰箱中保存備用；

不置換：繼續保存于FAA固定液中，不進行乙醇置換。

1.3 細胞學觀察

分別取經不同乙醇置換處理后的材料，按照劉海英等[13]的方法進行I2-KI法和DAPI法染色和制片，在Leica DMIL倒置熒光顯微鏡下(目鏡10×，物鏡20×)觀察小孢子發育過程觀察并統計花粉育性[13-14]。

1.4 自交結實率調查統計

于抽穗后開花前隨機選取10個麥穗分別套袋，成熟期按國內法[8]調查和統計自交結實率。

1.5 數據分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0進行數據統計、處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同乙醇置換處理對小麥小孢子發育進程中不同染色法染色效果的影響

2.1.1 對I2-KI法染色效果的影響

由圖1可知，采用FAA固定后經90%-80%-70%處理，I2-KI法染色后，在單核期，鄭麥366(圖1A)和BNS366小孢子(圖1E)均可以觀察到一個被染至黑褐色的細胞核，與鄭麥366相比，BNS366的細胞核辨識度相對較高。在二核期之后，絕大部分鄭麥366小孢子形狀規則，始終維持圓形，細胞內可見淀粉積累，并隨著發育進程繼續，積累量逐漸增加，至開花期充滿整個細胞，其細胞核在二核期由于淀粉遮擋模糊難辨，至三核期之后被遮擋程度加重以致完全無法顯示；BNS366的小孢子在二核期之后開始出現皺縮變形，僅有少數淀粉積累，大部分細胞難以正常進入二核期，細胞核逐漸減小甚至消失。由圖2可知，與90%-80%-70%處理相比，采用70%-70%處理，I2-KI法染色后，在二核期，細胞核辨識度略有提高，但同樣由于染色區域的遮擋難以滿足細胞學觀察的要求；二核期之后鄭麥366淀粉積累區域顯色略深，BNS366細胞質和細胞核區域仍呈I2-KI溶液本身的黃褐色，其顏色也略深，但均不影響開花期花粉育性的判斷。由圖3可知，與90%-80%-70%和70%-70%處理相比，不置換處理的細胞核辨識度和70%-70%較為接近，且二核期后鄭麥366淀粉積累區域顯色和BNS366細胞質和細胞核區域黃褐色均較深。

以上結果說明，從單核期向二核期轉變的階段為BNS366小孢子的敗育時期。三種乙醇置換處理下，I2-KI法染色均可以清晰顯示小孢子內淀粉積累情況，可輔助判斷花粉育性，按小孢子內淀粉積累區域顏色由深到淺排序為：不置換>70%-70%>90%-80%-70%。但因染色區域存在淀粉遮擋，均無法觀察小孢子二核期之后的細胞核發育情況。

A～D:鄭麥366; E～F:BNS366; A、E:單核期; B、F:二核期; C、G:三核期; D、H:開花期. 下同。

圖2 70%-70%處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的I2-KI染色結果Fig.2 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 treated with 70%-70% ethanol replacement and stained with I2-KI

圖3 不置換處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的I2-KI染色結果Fig.3 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 with non-replacement and stained with I2-KI

2.1.2 對DAPI法染色效果的影響

由圖4、圖5和圖6可知，采用FAA固定后采用不同乙醇置換，DAPI法染色與I2-KI法染色觀察到的鄭麥366和BNS366小孢子發育過程中細胞外形的變化和內容物的積累情況相似，不同之處在于細胞內容物積累情況僅能通過略顯白色區域判斷。采用3種處理，在鄭麥366小孢子發育的不同時期，均可見到發白發亮的細胞核，且隨著發育進程的推進，細胞核的染色程度加重，與細胞質略顯白色背景之間形成強烈反差，單核期能清晰觀察到一個清晰的細胞核，二核期能清晰觀察到兩個清晰地細胞核，三核期能清晰觀察到三個清晰的細胞核，開花期能夠清晰看到一個圓形營養核和兩個梭型精核，細胞核辨識度明顯高于I2-KI法。BNS366小孢子細胞核染色程度比鄭麥366淺，大部分小孢子內僅有一個細胞核，少數細胞可見兩個細胞核，有的觀察不到細胞核，至開花期細胞核消失不見，個別小孢子內可見一個皺縮變小的細胞核。

由圖4可知，采用FAA固定后90%-80%-70%處理下，DAPI法染色后，在單核期，鄭麥366(圖4A)和BNS366小孢子(圖4E)均能觀察到一個發白發亮的細胞核，以鄭麥366的細胞核清晰度相對較高且比較明亮，而BNS366細胞核則相對較暗。在二核期，鄭麥366(圖4B)細胞核明亮程度增加，能清晰地觀察到兩個發白發亮的細胞核，BNS366(圖4F)小孢子的細胞質和細胞核區域較暗，細胞質微紅，少數小孢子隱約可見一個細胞核。大部分細胞無法進入二核期，二核期細胞核出現逐漸變小的現象，至二核期之后消失。在三核期，鄭麥366(圖4C)可觀察到三個發白發亮的細胞核，BNS366(圖4G)僅有極個別小孢子可以看到亮度較弱的一個或兩個細胞核，細胞質微紅。至開花期，鄭麥366(圖4D)能夠清晰看到一個圓形營養核和兩個梭型精核，BNS366(圖4H)則出現明顯的皺縮變形，多數細胞看不見細胞核。由圖5可知，與90%-80%-70%處理相比，70%-70%處理下小孢子細胞圖像稍暗，能清晰觀察到細胞核的形態特征，在鄭麥366三核期和BNS366的二核期也存在細胞質微紅現象，且程度略有加重。由圖6可知，與90%-80%-70%和70%-70%處理相比，不置換處理的細胞圖像清晰程度較差，鄭麥366和BNS366單核期和開花期小孢子細胞圖像清晰，鄭麥366三核期小孢子細胞核暗淡不易觀察，細胞質發白渾濁，或發紅發亮，甚至部分細胞核被染成紅色，細胞質和細胞核反差小，BNS366二核期和三核期小孢子細胞質著紅色且比70%-70%處理下程度加劇。

以上結果說明，DAPI法染色可以清晰顯示BNS366小孢子細胞核不能正常分裂進入二核期，核發育停滯甚至消失的典型細胞學變化，與I2-KI法染色結果中BNS366在單核期至二核期出現敗育的現象相吻合。3種處理按細胞圖像清晰度排序為：90%-80%-70%>70%-70%>不 置換。

圖4 90%-80%-70%處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結果Fig.4 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 treated with 90%-80%-70% ethanol replacement and stained with DAPI

2.2 花粉育性與自交結實率比較

在鄭麥366開花期取樣，FAA固定后分別采用3種乙醇置換處理，2種染色方法對花粉染色后統計花粉育性，并與成熟期自交結實率進行比較。結果表明，三種處理下，I2-KI法和DAPI法的花粉可育率分別為77.91%和85.66%(90%-80%-70%)、87.38%和86.41%(70%-70%)、 87.19%和86.8%(不置換)，均與調查的自交結實率(80.33%)一致。這表明FAA固定后三種處理對小麥花粉育性統計結果無實質性影響。

圖5 FAA固定后70%-70%處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結果Fig.5 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 treated with 70%-70% ethanol replacement and stained with DAPI

圖6 不置換處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結果Fig.6 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 with non-replacement stained with DAPI

3 討 論

FAA固定后采用3種乙醇處理，經2種染色法對小麥小孢子染色，I2-KI法染色鄭麥366開花期細胞核被淀粉遮蓋出現黑褐色，DAPI染色下可以將鄭麥366花粉粒細胞核染至發亮，而BNS366的花粉粒未能被染色，均可以觀察到BNS366敗育時期在單核期到二核期，與賀曉敏等[7]的研究結果相一致。鄭麥366表現出正常可育小麥的小孢子發育細胞學特征。表明以此為試驗模型來開展相關的細胞學觀察準確可靠，可以進一步開展采用FAA固定液在三種不同置換條件下細胞學觀察效果的比較研究。

FAA是一種快速、廉價的固定液，常用于小麥小孢子等植物材料的細胞學觀察[15]，劉海英等[13-14]研究表明，FAA適用于小麥小孢子I2-KI法和DAPI法染色后淀粉積累情況和細胞核發育狀態的細胞學觀察。小麥穗等植物樣品在FAA固定24 h后，繼續固定容易出現細胞硬化過度而導致細胞染色效果不佳的現象，常采用乙醇置換并最終保存在70%乙醇中。劉子涵等[16]試驗中，采用FAA固定后，用70%乙醇漂洗3次后保存在70%乙醇中。在趙 卜等[10]的試驗中，FAA固定24 h后抽真空經95%乙醇和80%乙醇沖洗，轉入70%乙醇中保存。在張鵬飛等[17]和盛 英等[18]的試驗中，用FAA固定后保存在70%乙醇中。劉海英等[13]在FAA固定鄭麥366和BNS366小麥穗后，采取90%-80%-70%-70%乙醇置換各30 min，70%乙醇中保存的乙醇置換處理，經I2-KI法和DAPI法染色在小孢子淀粉積累和細胞核狀況觀察中均取得了良好的顯示效果。本試驗結果顯示，樣品采用FAA固定后經不同乙醇置換處理，I2-KI法染色后小麥小孢子細胞學觀察效果出現規律性變化，90%-80%-70%處理下，其乙醇濃度呈梯度下降，置換次數為3次，在所有處理中次數最多，淀粉染色效果最淺；70%-70%處理下，乙醇濃度無梯度變化，置換次數為兩次，淀粉染色效果比90%-80%-70%增強；不置換處理下，不涉及乙醇置換，淀粉染色程度最深，表明，隨乙醇濃度梯度下降和置換次數增加，淀粉著色減弱，三種處理均不影響對小孢子細胞學特征和花粉育性的判斷。樣品采用FAA固定后經不同乙醇置換處理，DAPI法染色后小麥小孢子細胞學觀察效果也出現規律性變化，90%-80%-70%處理下，紫外光下細胞核熒光較強，細胞質和細胞核區域亮度較高，細胞核辨識度高；70%-70%處理下，紫外光下小孢子細胞核熒光強度適中，在鄭麥366三核期和BNS366的二核期也存在細胞質微紅現象且程度略有加重,但不影響細胞學觀察；不置換處理下，紫外光下細胞核熒光較弱，鄭麥366三核期小孢子細胞核暗淡不易觀察，細胞質發白渾濁，或發紅發亮，甚至部分細胞核被染成紅色，細胞質和細胞核反差小，BNS366二核期和三核期小孢子細胞質著紅色且比70%-70%處理下程度加劇，細胞核辨識度低，無法滿足細胞學觀察的需要。這表明，隨乙醇濃度梯度下降和置換次數增加，細胞核著色增加，細胞質著色程度減弱，細胞學觀察效果逐漸改善。FAA固定后經3種乙醇置換處理，2種染色方法染色后，對花粉育性統計結果均無實質性影響。

綜上所述，與90%-80%-70%相比，70%-70%處理下，I2-KI法和DAPI法染色后，細胞學觀察效果略差，其淀粉積累情況、細胞核清晰程度、細胞質著色狀況仍能滿足細胞學觀察的要求，但省試劑、省時間、省人力；與不置換相比，70%-70%處理細胞學觀察效果較好，且操作人員制片時，僅接觸到樣品和保存液中的70%乙醇，與FAA固定液相比，過敏、刺激、化學性燙傷和中毒等風險均大大降低，對操作人員健康的保障效果更好。因此，在本試驗條件下，70%-70%乙醇置換處理較為可取。