維生素E對小麥赤霉病菌嘔吐毒素積累的調控效應

朱素芹，張語卉，花 辰，李 磊，孫政璽，李 韜

(揚州大學植物功能基因組學教育部重點實驗室/江蘇省作物基因組學與分子育種重點實驗室/ 江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室，江蘇揚州 225009)

小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌引起的一種真菌性病害，主要發生在長江中下游麥區和東北春麥區[1]，近年來在黃淮冬麥區也流行成災[2-3]。小麥感染赤霉病后不僅嚴重影響產量[4-5]，而且感病籽粒中積累的毒素嚴重降低了籽粒品質[6-7]。禾谷鐮刀菌產生的毒素主要有兩大類，包括單端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮[8]，其中單端孢霉烯族毒素是有毒的倍半萜化合物，包括A、B、C三種類型，其中B型單端孢霉烯族毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是侵染小麥最重要的致病因子[9]，能夠延緩或終止蛋白的生物合成[10]。DON又稱嘔吐毒素，它和瓜萎鐮菌醇(NIV)及二者的衍生物(3ADON、15ADON和4ANIV)等毒素是世界公認的致癌物質[11]，會引起中毒者眩暈、發燒、惡心、腹瀉等癥狀，嚴重時會引起出血，影響免疫力和生育力等，直接對人畜健康和生命安全構成威脅[12]。近年來市場上面粉廠屢次被檢測出DON含量超標，因此嚴格控制小麥赤霉病的發生、減少DON的積累才能保證食品安全。我國《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》規定，小麥粉、小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標準為1 000 μg·kg-1[13]。目前，還未發現有效控制 DON 污染的途徑。

維生素E是植物體內重要的脂溶性抗氧化劑，包括生育酚和生育三烯酚[14],小麥中的生育酚主要存在于胚中，生育三烯酚存在于果皮和胚乳(含量更高)中[15]。維生素E的生物合成過程主要發生在葉綠體中[16]，莽草酸途徑和非甲羥戊酸途徑的化合物作為合成的前體，莽草酸途徑的產物尿黑酸(HGA)作為底物生成維生素E親水性頭部，非甲羥戊酸途徑的產物植基二磷酸(PDP)或香葉基香葉基二磷酸(GGDP)分別是形成生育酚和生育三烯酚的前體[17-19]。維生素E不僅是一種抗氧化劑，也是強自由基清除劑[20]，能及時清除活性氧，防止脂質過氧化的發生[21]。維生素E還可以保護光合系統中蛋白質、色素和多聚不飽和脂肪酸免受氧化損傷[22]。Foyer等[23]推測維生素E可能和其他抗氧化機制共同發揮作用來維持細胞體內氧化還原水平的平衡。

王 旭等[24]研究表明，禾谷鐮刀菌侵染小麥籽粒后，導致機體和細胞的脂質過氧化和DNA氧化損傷。Rizzo等[25]發現，在飼料中添加維生素E能降低DON的毒性作用，從膳食中攝入維生素E能緩解DON引起的急性中毒。但迄今為止，禾谷鐮刀菌在活體和離體培養條件下，維生素E對DON積累是否有調控作用尚未見報道。因此，本試驗在活體條件下解析維生素E對小麥赤霉病病小穗率、籽粒毒素含量的效應，以及在離體條件下解析維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲生長、DON含量和DON合成關鍵基因Tri5表達的影響，評價維生素E對DON積累的效應，以期為利用維生素E防控小麥赤霉病菌毒素提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 活體試驗材料與方法

1.1.1 小麥材料

試驗于2018年10月在揚州大學試驗田種植高感小麥赤霉病品種Clark，播種6行，每行15株。

1.1.2 試驗所用菌株及其菌液制備

本試驗所用菌株為F1312(江蘇省農科院陳懷谷研究員提供)。利用滅菌后的接種環挑取純菌株斜面上的禾谷鐮刀菌邊緣菌體，接種于滅菌的PDA培養基上，于25 ℃恒溫培養5～7 d，用滅菌后直徑7 mm的圓形打孔器取8塊活化的禾谷鐮刀菌菌塊放入80 mL滅菌的綠豆湯培養基中以180 r·min-1、26 ℃搖培72～120 h，吸取1 μL 孢子液，滴到血球計數板上，置于顯微鏡下測定孢子濃度，然后稀釋或濃縮到接種需要的濃度(1×105個· mL-1)。

1.1.3 維生素E溶液的制備

自然情況下，小麥籽粒本體維生素E含量的均值為0.352 μg·g-1[26]。吸取100 μL維生素E溶液(相當于1 μg·μL-1)(上海生工生物工程股份有限公司)配制成50 mL的維生素E母液，有機相微孔濾膜過濾維生素E母液，置于4 ℃冰箱保存。配置三個濃度梯度的維生素E溶液，分別為本體含量的1倍(3.5×10-4μg·mL-1)、5倍(17.5×10-4μg·mL-1)、10倍(3.5×10-3μg·mL-1)。

1.1.4 禾谷鐮刀菌菌液和維生素E接種及鑒定

采用雙花滴注法(bilateral florets inoculation method， BFI)，在小麥揚花期利用醫學注射器吸取20 μL制備好的禾谷鐮刀菌菌液，滴注在倒五小穗雙側小花的內外穎之間，同時在其上下兩側(倒四、倒六)小穗雙側小花的內外穎之間滴注上述三種濃度的維生素E溶液各20 μL，以只滴注禾谷鐮刀菌菌液為對照(CK)，共4個處理，每個處理接種5個穗子，記載接種日期，接種21 d后鑒定感病小穗數，病小穗率=感病小穗數/總小穗數。

1.1.5 籽粒中DON含量的測定

(1)實驗儀器：三重四級桿液質聯用儀(Thermo Fisher，美國)。

(2)標準液制備：毒素原液DON及三種DON的衍生形態，即3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3A-DON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15A-DON)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(D3G)(Fermentek，以色列)，用10%乙腈水配置成100 ppb混標溶液。

(3)樣品前處理：樣品的前處理方法參照靳夢瞳等[27]的方法。收獲后小麥穗脫粒，磨樣機磨碎后，稱取2 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈/水溶液(84/16,v/v)，迅速渦旋振蕩，超聲30 min后，離心5 min，吸取2 mL上清液轉至新的10 mL離心管，加入150 mg無水硫酸鎂，渦旋振蕩后吸取上清液轉至新的10 mL離心管。再加入1 mL正己烷脫脂后，渦旋離心去除正己烷層，用氮氣吹干剩余上清液，最后用乙腈/水溶液(15/85,v/v)定容至1 mL。渦旋并過0.22 μm尼龍濾膜后，進行LC-MS分析。

(4)色譜及質譜條件：色譜及質譜條件參照靳夢瞳等[27]的方法，略有改進。色譜條件：選用ACQUITYUPLCHSST3(2.1×100 mm，1.8 μm)色譜柱，柱溫40 ℃，樣品溫度5 ℃。進樣體積為5 μL，流速0.3 mL·min-1。采用流動相(A)甲醇和流動相(B)醋酸銨組成的流動相進行梯度洗脫。洗脫程序：0 min 20%(A)，1.0 min 20%(A)、5.5 min 90%(A)，6.5 min 90%(A)、7.0 min 20%(A)。質譜條件：選擇反應監測模式(MRM)檢測。曲線脫溶劑管(CDL)溫度250 ℃，霧化氣體和干燥氣體均為氮氣，流速分別為3.0、15.0 L·min-1。碰撞氣為高純氬氣，碰撞誘導解離壓力為230 kPa。

1.2 離體試驗材料與方法

1.2.1 含有維生素E的PDA和TBI培養基的配制及禾谷鐮刀菌培養

分別在滅菌后的PDA以及TBI培養基[28]中加入小麥本體維生素E含量1倍、5倍、10倍的維生素E溶液，以不添加維生素為對照(CK)，充分混勻并量取20 mL于培養皿中，各處理兩個重復，待冷卻凝固后，用滅菌后直徑7 mm的圓形打孔器取一塊活化的禾谷鐮刀菌菌塊于培養皿的中心位置，最后用無菌封口膜封口并置于25 ℃恒溫培養。

1.2.2 禾谷鐮刀菌菌絲生長速率的測定

每隔24 h拍照記錄菌絲生長速度，用游標卡尺通過十字交叉法測量禾谷鐮刀菌菌絲的生長直徑，直至菌絲長滿培養皿。

1.2.3 含有維生素E的PDA和TBI培養基中DON含量的測定

用消毒后的刀片將培養基切碎，將培養基：ddH2O按1∶1比例置于錐形瓶中，180 rpm搖培30 min后，用雙層紗布過濾，收集濾液，利用ELISA試劑盒(Beacon Analytical Systems Inc.)進行測定，具體過程參照廠家說明書。

1.2.4Tri5基因表達量的測定

用滅菌后的鑷子挑取禾谷鐮刀菌菌絲于液氮中快速研磨，采用Takara Trizol法提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用Takara反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)進行cDNA的合成。赤霉菌Tri5以及內參基因Tublin的引物序列參照王亞君等[29]的方法，實時定量PCR(qRT-PCR)具體方法參照產品說明書(TaKaRa,RR047A)。

2 結果與分析

2.1 活體條件下維生素E對小麥赤霉病病小穗率及籽粒中DON含量的影響

活體條件下，不同濃度的維生素E處理均不能降低高感赤霉病小麥品種Clark的病小穗率(表1)，說明維生素E對小麥赤霉病的擴展無 影響。

方差分析表明，接種不同濃度的維生素E后，小麥籽粒中DON含量均與對照呈極顯著差異。多重比較結果表明，對照籽粒中DON積累量最高，所有維生素E處理下籽粒中DON含量均顯著低于對照，17.5×10-4μg·mL-1維生素E處理下籽粒中DON含量也顯著低于3.5×10-4μg·mL-1的維生素E處理，3.5×10-3μg·mL-1維生素E處理與17.5×10-4μg·mL-1維生素E處理下籽粒中DON含量無顯著差異，表明適量的維生素E能夠顯著減少小麥籽粒中DON的積累(表1)。

2.2 PDA培養基上維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲生長和DON積累的影響

與不添加維生素E的對照相比，添加不同濃度維生素E的PDA培養基上禾谷鐮刀菌菌絲的生長速率無明顯差異(圖1)。多重比較結果表明，不同處理間的禾谷鐮刀菌菌絲在同一時間點直徑均無顯著差異(表2)，說明在PDA離體條件下，添加不同濃度的維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲的生長無顯著影響。

在添加不同濃度維生素E的PDA培養基上培養禾谷鐮刀菌，4 d 后測定培養基中積累的DON含量，方差分析表明，不同處理間的DON含量無顯著差異(P=0.29)，說明在PDA離體培養條件下，添加不同濃度的維生素E對禾谷鐮刀菌中DON含量均無顯著影響。

表1 小麥品種Clark在赤霉菌和不同濃度維生素E接種下的病小穗率及籽粒中的DON含量Table 1 DON content in Clark inoculated with F.g. and vitamin E under different concentrations

1 d、2 d、3 d、4 d為離體培養天數；VE0、VE1、VE5和VE10分別表示添加維生素E的濃度為0、3.5×10-4、17.5×10-4和3.5×10-3 μg·mL-1。圖2同。

表2 不同維生素E濃度處理下不同時間點PDA培養基上禾谷鐮刀菌菌絲的直徑Table 2 Hypha growth diameter in PDA medium under different concentrations of vitamin E at different time mm

2.3 TBI培養基上維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲生長和DON積累的影響

與不添加維生素E的對照相比，添加不同濃度維生素E的TBI培養基上禾谷鐮刀菌菌絲生長速率無明顯差異(圖2)。多重比較結果表明，不同處理間的禾谷鐮刀菌菌絲在同一時間點直徑均無顯著差異(表3)，說明在TBI離體條件下，添加不同濃度的維生素E對禾谷鐮刀菌菌絲生長均無顯著影響。

圖2 不同濃度的維生素E對TBI培養基上禾谷鐮刀菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of vitamin E under different concentrations on the growth of hypha in TBI medium

表3 不同維生素E濃度處理下不同時間點TBI培養基上禾谷鐮刀菌菌絲的直徑Table 3 Hypha growth diameter in PDA medium under different concentrations of vitamin E at different time mm

在添加不同濃度維生素E的TBI培養基上培養禾谷鐮刀菌，4 d后測定培養基中積累的DON含量。方差分析表明，不同處理間的DON含量無顯著差異(P=0.12)，說明在TBI離體培養條件下，添加不同濃度的維生素E對禾谷鐮刀菌中DON含量均無顯著影響。

2.4 離體條件下維生素E對 Tri5基因表達量的影響

分別提取在TBI培養基上培養3、4和5 d的禾谷鐮刀菌菌絲RNA，進行熒光實時定量PCR(qRT-PCR)。結果表明，在培養3、4和5 d時，添加維生素E培養的菌絲中，Tri5基因的表達量與對照之間均無顯著差異；但在培養4 d時，Tri5基因的表達量在維生素E濃度為3.5×10-4和17.5×10-4μg·mL-1的處理之間有顯著差異(表4)。

表4 添加不同濃度維生素E的TBI培養基培養4 d 時 Tri5基因的表達量Table 4 Expression level of Tri5 gene at the 4th day in TBI medium with VE

3 討 論

本研究通過活體和離體試驗表明，在活體條件下維生素E能顯著減少籽粒中DON含量的積累，并且在一定范圍內，隨著維生素E濃度的增加，DON含量逐漸減少，說明在活體條件下維生素E處理負調控DON毒素的積累，但不能降低病小穗率，即不能阻止病原菌在穗部的擴展，間接說明禾谷鐮刀菌侵染是毒素積累的前提，但病小穗率與毒素積累量沒有必然聯系。而在離體條件下，不論是在PDA上，還是產毒培養基TBI上，與對照相比，維生素E既不影響菌絲生長，也不能抑制病原菌產毒和下調Tri5基因的表達，說明在離體和活體條件下，維生素E對赤霉菌生長的效應一致，但在產毒效應上有差異，推斷禾谷鐮刀菌本身缺乏對維生素E的應答能力，維生素E的抗氧化效應沒有被激發，而活體上維生素E負調控毒素的產生，很可能是通過調控寄主小麥中相關基因的表達而間接調控禾谷鐮刀菌產毒相關基因的表達。Atroshi等[30]和Rizzo等[31]的研究表明，維生素E是脂質抗氧化劑，它可以保護DNA免受DON的有害影響，從另一個角度證明了維生素E對降低DON危害的正面效應。小麥在揚花和灌漿期容易受到禾谷鐮刀菌的侵染，導致籽粒中會積累毒素[32]，綜合本研究結果，認為植株上用維生素E處理，可以在一定程度上降低或控制毒素積累，為小麥禾谷鐮刀菌的毒素防控提供新的選擇，對保障食品安全有一定的意義。