PINK1-parkin途徑及其與心肌缺血再灌注損傷的關系

任鵬鵬 韓沖芳 李浩甲 王文杰

根據《中國心血管病報告2018》報道，由于人口老齡化等原因，我國心血管病發生率連續多年上升，目前患者人數將突破2.9億[1]。心血管病已經超越腫瘤等惡性疾病，成為中國城鄉居民死亡的首位原因，對個人和社會的帶來極大的負擔，成為重大公共衛生問題。我國醫療水平發展迅速，但是由于高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、肥胖、環境污染等高危因素的影響，心血管病的發生率和病死率仍然居高不下。心肌缺血時，盡快恢復心肌血液供應是治療的最主要手段。然而不論是心肌梗死患者血管內溶栓、介入手術，或是心臟的外科手術，缺血的心肌組織恢復血流灌注時，復灌心肌損傷并未完全恢復，甚至會產生更加嚴重乃至不可逆的損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。MIRI的確切機制尚未明確， 以往的研究多認為與炎性反應、線粒體膜通透性轉換孔、細胞內鈣超載及氧化應激損傷和凋亡相關機制等因素有關。目前，MIRI被發現與線粒體的各種調節機制和信號途徑的激活和失活關系密切。

線粒體是細胞的“發動機”。心肌細胞各種活動需要線粒體的氧化磷酸化作用生成ATP提供能量。心肌細胞內含有大量線粒體，在MIRI時，氧化磷酸化會產生大量的活性氧 (reactive oxygen species, ROS)攻擊自身的線粒體膜結構，造成了線粒體膜電位受損、結構和功能的損傷，心肌細胞功能受到影響。有研究認為線粒體自噬與MIRI關系密切，特別是PINK1-parkin途徑所誘發的線粒體自噬，在MIRI中的作用越來越引起人們的重視。本文主要闡述PINK1-parkin途徑的機制及其與MIRI的關系。

一、細胞自噬與線粒體自噬

自噬是細胞回收過量或者有損傷的細胞質和細胞器，并為細胞和有機體生存提供所需的能量及底物的過程，參與細胞組分的常規更新、針對性識別和清除特殊的蛋白聚集，還參加了生物體的各種發育、分化和組織重塑過程[2]。其大致過程為細胞質或細胞器被自噬體包裹，轉運至溶酶體中分解，產物又回到胞質中重新合成代謝。自噬主要有3種類型，包括分子伴侶介導的自噬、巨自噬及微自噬。巨自噬發現最早，對其研究也較為深入。巨自噬與細胞存活和細胞死亡有著廣泛的聯系，適度自噬對細胞功能有重要作用，而過度自噬導致的細胞死亡。這種死亡方式已被證明是通過凋亡等途徑導致細胞死亡[3]。多年來，自噬被發現與包括心力衰竭、動脈粥樣硬化、MIRI等在內的多種心血管疾病的發生有關。根據被吞噬物有無特異性，巨自噬又分為選擇性自噬和非選擇性自噬。

線粒體自噬是一種選擇性自噬。它可以特異性清除功能異常或結構受損的線粒體，對線粒體數量和質量進行調節，支持細胞的正常生理活動[4]。自噬被發現已經由來已久，但是長期以來被認為是一項隨機而非具有特異性的過程，而“線粒體自噬”這一概念在2005年才被提出。多年以來，研究者發現線粒體自噬與衰老、神經退行性疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥和缺血再灌注損傷等多種過程息息相關[5]。在哺乳動物中，調控線粒體自噬的主要信號通路有PINK1/parkin途徑、BNIP3/NIX途徑和FUNDC1途徑、內膜蛋白抗增殖蛋白 (prohibitin, PHB)途徑等，這些通路并非完全獨立。

二、PINK1-parkin途徑

1.PINK1蛋白和parkin蛋白:PINK1 蛋白是一種絲/蘇氨酸激酶，最早被發現與遺傳性早發帕金森病有關，由581個氨基酸組成。細胞生理狀態下，與之運轉有關的酶有線粒體外膜移位酶(translocase outer membrane, TOM)復合物、內膜轉運酶23(translocase of the inner membrane 23，TIM23)和線粒體內膜早老素相關的菱形樣(presenilin-associated rhomboid-like，PARL)蛋白。PINK1蛋白在TOM、TIM23作用下進入基質，被線粒體內PARL蛋白快速切割其特定位置而降解，這使在健康的線粒體中PINK1水平非常低甚至無法檢測到[6]。

parkin蛋白由PAEK2基因編碼，廣泛表達于各種組織，尤其在大腦和肌肉細胞的細胞質內富集。人們發現其與PINK1蛋白位于同一途徑之中，且位于下游。泛素化是指泛素對目標蛋白進行分類和修飾的過程。蛋白質泛素化過程需要3個酶，即泛素活化酶(E1)、泛素交聯酶(E2)和泛素連接酶 (E3)。parkin蛋白末端含有1個與泛素76個氨基酸同源的泛素樣結構域，是一種E3泛素連接酶。線粒體受損時，parkin蛋白會從胞質中轉移到線粒體外膜上，并協同E1和E2泛素化修飾受損線粒體的外膜蛋白。parkin蛋白對底物的特異性要求較低，能泛素化修飾多種蛋白，如己糖激酶1(hexokinase，HK1)、電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)蛋白、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn2)等[7]。

2.PINK1-parkin途徑：PINK1蛋白末端具有可被TOM識別的帶有正電荷的特異性序列，由胞質進入線粒體內膜時有賴于正常的線粒體膜電位差驅動。在線粒體處于缺氧、高糖等不利條件下，線粒體去極化，TOM和TIM23活性減弱，PINK1蛋白不能由線粒體外進入內膜被分解，導致其在線粒體外密集分布。因此，PINK1蛋白可被稱為識別線粒體膜電位變化的生物“吹哨者”。線粒體膜電位降低或消失時，聚集在線粒體外膜的PINK1蛋白被磷酸化而被激活，其激活機制可能與其自身結構所致自我磷酸化有關[6]。之后PINK1蛋白磷酸化線粒體外膜的泛素，磷酸化的泛素和parkin蛋白的之間有很高的親和力，促進了parkin蛋白的聚集和E3泛素連接酶的激活[8]。parkin被激活后使HK1、VDAC1、Mfn1和Mfn2等線粒體蛋白泛素化，這些在線粒體周圍富集的泛素化蛋白又被PINK1磷酸化激活，從而在線粒體上形成了正反饋的放大激活機制。隨后泛素化的蛋白被自噬受體蛋白p62、OPTN、NBR1、Tax1BP1和NDP52等識別。p62 是一種銜接蛋白，一端連接線粒體膜蛋白上的泛素鏈，另一端通過LIR結構域與微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)特異性結合。LC3是自噬體上的受體蛋白，和p62等連接后激活自噬途徑，隨后線粒體被自噬體吞噬，形成新的混合結構進入溶酶體內降解。

以上經典PINK1-parkin途徑介導的線粒體自噬，可以概括為4步：(1)PINK1、parkin蛋白的激活。(2)線粒體膜蛋白泛素化。(3)線粒體自噬體的形成。(4)線粒體-自噬溶酶體形成：溶酶體吞噬于其中進行降解。也有研究者提出“兩步走”模型，將線粒體自噬分為兩個階段：(1)線粒體自噬相關蛋白的活化。(2)LC3參與的自噬過程，線粒體被吞噬降解[9]。

此外，PINK1蛋白和parkin蛋白還參與線粒體活動的其他途徑，研究者發現線粒體抗原遞呈的機制可能與PINK1蛋白和parkin蛋白抑制的囊泡運輸途徑有關[10]。有研究發現，對小鼠PINK1基因進行敲除，并且在使用線粒體解偶聯劑處理后，parkin蛋白仍然可以被受損線粒體招募和激活[11]。由此可見parkin蛋白的激活并不完全依賴于PINK1，兩者之間或許存在某種補充機制。最近Lee等[12]研究發現，由AMP激活的蛋白激酶(AMPK)介導parkin蛋白激活的AMPK-parkin軸。除此以外，研究還發現了一種新型E3泛素連接酶，以和parkin蛋白類似的方式引起線粒體自噬，并且這一過程依賴于PINK1蛋白[13]。在對parkin蛋白基因的敲除后，研究找到了由PINK1募集的自噬受體蛋白的存在[14]。可見，除了經典的PINK1-parkin途徑之外仍有其他旁路的存在。

3.線粒體動力學與線粒體自噬:正常細胞內線粒體不是始終不變的，而是處于高度變化的狀態中。為適應生長發育的不同時期和環境條件，線粒體處在持續分裂和融合的動態平衡之中，稱之為線粒體動力學。在細胞正常的生理條件下這種平衡可以對線粒體的數量、形態和功能進行限制和調節。細胞中負責調整線粒體分裂和融合的物質包括線粒體分裂相關蛋白和融合相關蛋白。

調控線粒體融合的蛋白包括視神經萎縮因子1(optic atrophy 1，OPA1)、粒體融合蛋白1(mitofusion1，Mfn1)和Mfn2。這些物質水解GTP獲能并融合位置相近的線粒體，從而共享線粒體內核酸、蛋白質等物質。Mfn1/2負責線粒體外膜融合，而OPA1則介導線粒體內膜的融合。線粒體分裂機制是線粒體融合蛋白抑制和線粒體分裂蛋白激活的統一。調控線粒體分裂的蛋白主要包括動力蛋白相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)、線粒體分裂因子(mintochondrial fission factor，Mff)和分裂因子1(fission 1，Fis 1)。Drp1位于胞質內，線粒體分裂過程中被募集到線粒體外膜，占主要作用，Mff、Fis1起到輔助作用。線粒體融合、分裂過程的任何改變都可能對線粒體功能造成影響。在對小鼠Mfn1、Mfn2和Drp1基因三聯敲除的實驗中，小鼠心臟損傷并沒有單一敲除的嚴重，從中可見“平衡”的重要性[15]。

線粒體分裂在細胞分裂、線粒體移動、凋亡等活動的信號轉導中起到重要作用。有研究指出，對小鼠Drp1基因敲除后心肌細胞線粒體形態改變、線粒體自噬被抑制，引起線粒體結構受損和功能障礙[16]。線粒體融合和分裂的狀態會影響線粒體自噬的水平：線粒體分裂使線粒體自噬向正方向發展，線粒體融合則減少線粒體自噬的發生。此外上文中提到Mfn1、Mfn2作為線粒體外膜蛋白是parkin蛋白泛素化修飾的底物之一，因此線粒體自噬的狀態同樣也會影響線粒體動力學。因此，線粒體自噬和線粒體動力學關系密切，兩者相互影響。

三、 PINK1-parkin途徑和MIRI的關系

健康狀態下穩定而平衡的線粒體自噬在心肌細胞正常生命活動中占有不可替代的重要作用，另一方面線粒體自噬的失衡則會引發心肌各種病變。parkin基因敲除小鼠的心肌細胞線粒體形態雜亂無章，較小且成簇，出現含有異常電子聚集的線粒體，并且隨著時間的推移異常線粒體逐漸累積。parkin對于心肌線粒體的成熟發育可能至關重要。parkin基因敲除小鼠心功能較對照組降低，并且在第3周時陸續死亡[17]。這些結果表明線粒體自噬在維持線粒體形態、穩定性方面發揮重要作用并且可能與心臟發育有關。在MIRI治療的探索中，對心肌進行缺血預處理被認為是減輕MIRI的有效手段，可以減輕心肌細胞對再灌注損傷的敏感度。研究發現，這與線粒體膜電位上升導致加速線粒體parkin蛋白的轉運、線粒體自噬被激活有關[18]。許多對MIRI有治療作用的藥物包括一些麻醉劑在內也被證明依賴PINK1-parkin途徑發揮作用。

在MIRI中可以觀察到線粒體內PINK1和parkin蛋白的的激活，但是兩者在其中的作用存在爭議。在小鼠心臟MIRI的體外實驗中，PINK1基因敲除后的心肌細胞與對照組比較線粒體膜電位降低，線粒體呼吸被抑制，線粒體功能發生障礙，心臟對MIRI的脆弱性增加[19]。在另一項關于parkin基因敲除研究中，發現實驗組相較于對照組小鼠線粒體紊亂，體積明顯變小，在MIRI中心肌損傷面積更大、小鼠生存率更低[20]。因此，PINK1-parkin途徑可能在MIRI中起到了保護作用。

高糖抑制線粒體自噬。實驗證明，糖尿病抑制了小鼠心肌細胞中PINK1和parkin蛋白的表達，線粒體自噬異常，使受損線粒體在細胞內堆積[21]。最近研究證實，抑制parkin依賴性線粒體自噬會導致糖尿病心肌病[22]。衰老是心肌細胞損傷的獨立危險因素。有研究發現，衰老細胞中線粒體分裂和線粒體自噬被抑制[23]。這說明在衰老、糖尿病等狀態中，心肌易受損傷的原因可能與線粒體自噬被抑制導致的損傷線粒體積累有關。

另外有研究證明PINK1-parkin途徑在MIRI過程中起到了負面的作用。例如，MIRI中不同階段給予Drp1抑制劑mdivi-1均能夠改善小鼠線粒體功能和心肌功能，減少梗死面積和心律失常的發生，其中在缺血前使用效果最佳[24]。G蛋白偶聯的雌激素受體1通過信號轉導抑制了MIRI時PINK1-parkin途徑，減少線粒體自噬，保護心肌免受MIRI影響[25]。其原因可能與抑制了過度的線粒體自噬有關。

綜上所述，線粒體自噬在MIRI中表現出了兩面性。這種兩者相對的結果可能是由于線粒體自噬水平、模型和處理條件不同引起的。因此不同模型缺血前線粒體自噬抑制或激活的狀態和水平就變得至關重要。這也提示在MIRI的治療中，不同的合并癥應采取不同的策略。

四、展 望

PINK1-parkin途徑對維持心肌細胞正常的功能和MIRI中的心肌保護具有重要作用，多種具有心肌保護作用的藥物和手段也被認為是通過PINK1-parkin途徑而發揮作用。然而這些方法在具體應用時卻并非完全有效，其原因可能與心肌梗死患者的諸多合并癥有關。不同合并癥中線粒體自噬的水平不同，因此在MIRI的治療切入點也不盡相同。最近在阿爾茲海默癥的研究中parkin蛋白過表達逆轉了線粒體的受損，成為治療該病的潛在方法之一[26]。同樣在MIRI中，根據具體情況調整線粒體自噬的程度，維持足量的健康的線粒體工作或許成為未來研究MIRI的方向。PINK1-parkin途徑也有望為合并高齡、糖尿病等高危因素時MIRI的治療提供新的思路和靶點。