LC-MS/MS測定比格犬血漿中的醉茄素A及其生物利用度研究

戴天明，王敏

1.廣州市紅十字會醫院/暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院/廣州市創傷外科研究所，廣東 廣州 510220；2.廣州市紅十字會醫院/暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院骨科，廣東 廣州 510220

南非醉茄是一種被民間廣泛利用的傳統草藥，它具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎和免疫調節等作用[1-3]。醉茄素A(Withaferin A,WA)是南非醉茄提取物中的主要活性成分[2]。近年來，有報道稱WA在膠質瘤小鼠模型中具有很強的抗腫瘤活性，而且WA對肥胖小鼠有強大的抗肥胖和抗糖尿病作用，因此備受關注[4,5]。雖然南非醉茄提取物的口服保健產品已上市多年，但其主要成分WA的口服生物利用度仍未知，現有報道僅停留在使用小鼠對WA進行初步藥代動力學研究[3]。為了探索WA的口服生物利用度，本研究利用LC-MS/MS檢測技術，采用藥物吸收行為與人體更為接近的比格犬，進行WA靜脈注射和口服灌胃的藥代動力學實驗，評估WA口服給藥的可行性，為藥物臨床前研發和臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物醉茄素A對照品(批號17136605，純度＞99.0%)和澤瀉醇C-23-醋酸酯對照品(內標物，批號16425087，純度＞99.0%)購自成都普菲德生物技術有限公司。色譜純的甲醇和乙腈購自美國Spectrum公司。其他試劑為市售分析純。超純水由Milli Q超純水系統制備。

比格犬共3只，雄性，體重6.3～7.1kg，健康狀況良好，購自北京瑪斯生物技術有限公司(實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2011-0003)。比格犬在給藥前12h開始禁食，直至給藥后4h恢復喂食。全程飲水自由。

1.2 儀器分析方法在日本Shiseido Nanospace 1312高效液相色譜系統和美國AB Sciex 4000 Q Trap?質譜儀上建立高效液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)分析方法。數據采集與定量軟件為Analyst 1.6。

WA分析的液相條件：采用Venusil MP C18(50×2.1 mm·5μm)色譜柱，流速為0.25mL/min，在室溫下分析WA。流動相A為水相(乙腈:水=5:95，V/V)，流動相B為有機相(乙腈:水=95:5，V/V)。水相和有機相中均含有10mM乙酸銨。液相系統采用梯度洗脫，有機相的起始比例為30%(V/V)，0.3min時有機相開始線性上升，0.5min時升至100%。之后保持100%至2.4min，然后開始線性下降。2.8分鐘時有機相比例回到30%，保持至4min結束洗脫流程。WA和內標物在此梯度下保留時間分別是1.9min和2.2min。

WA分析的質譜條件：正離子模式下，離子源溫度550°C，離子噴霧電壓5500V，氣簾氣15psi，霧化氣70psi，輔助氣60psi，碰撞氣中等，入口電壓9V，駐留時間120ms。WA和內標物在多反應監控MRM模式中，定量離子對分別為471.4～281.2m/z和529.6～451.5m/z，去簇電壓分別為100V和130V，碰撞能量分別為25eV和29eV。

1.3 標準曲線與質控樣品制備精密稱取WA對照品兩份，甲醇溶解，兩份對照品分別制備WA的標準曲線儲備液和質控儲備液，濃度為1mg/mL。內標物澤瀉醇C-23-醋酸酯對照品用甲醇溶解配制儲備液。WA的工作液濃度范圍為1～10000ng/mL，通過從儲備液連續稀釋后獲得。WA的標準曲線和質控樣品，采用空白比格犬血漿和工作液混合制備，標準曲線最終濃度為0.2、0.4、1、5、20、100、500、1600和2000ng/mL。質控樣品最終濃度0.4、20和1600ng/mL。所有的儲備液、工作液、含血漿標準曲線和質控樣品配制后馬上儲存在4°C冰箱中待用。

1.4 血漿樣品處理在100μL血漿樣品中，加入20μL純甲醇和50μL內標物(1μg/mL)，在冰水浴中渦旋混合。然后加入1.5mL乙酸乙酯，繼續在冰水浴中振蕩萃取15min。在4°C和14000g離心力下離心5min，取出上層溶液在真空下揮干。使用200μL流動相復溶，注入20μL上清到LC-MS/MS系統中分析。

1.5 藥代動力學實驗WA的藥代動力學實驗分為兩周期給藥，在3只雄性比格犬進行。第一周期進行WA劑量為1mg/kg靜脈注射給藥實驗，第二周期進行WA劑量為2mg/kg口服灌胃給藥實驗，清洗期為7d。WA給藥溶液濃度為1.7mg/mL，使用乙醇-solutol HS 15-純水(10:5:85;V:V:V)的溶劑配制。靜脈給藥實驗采血時間點為：0、0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h；口服給藥采血時間點為：0、0.05、0.13、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48h。給藥前和給藥后從比格犬前肢靜脈采集血液約500μL，注入肝素鈉抗凝的離心管中，在4°C、3000g離心力離心5min，收集上層血漿，-80℃冰箱保存待用。

1.6 藥代動力學參數計算檢測得到的血藥濃度-時間數據，采用DAS(Direct-Attached Storage,DAS)3.0軟件的統計矩模型計算藥代動力學參數，包括藥時曲線下面積AUC(Area Under Curve,AUC)、半衰期t1/2、平均駐留時間MRT、清除率Cl、表觀分布容積Vd等[6]。

2 結果

2.1 最低定量限與線性范圍通過優化液相條件，調整流動相成分(乙酸銨和甲酸含量)，以及優化藥物萃取條件(乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙醚對比)，WA的最低定量限為0.2ng/mL，信噪比＞5。通過線性回歸擬合的標準曲線線性范圍為0.2～2000ng/mL，回歸方程y=0.0016x+0.005，相關系數r2＞0.999，表明此濃度范圍內線性關系良好。

2.2 WA在比格犬的藥代動力學參數對LC-MS/MS分析方法測得的藥物濃度數據，在DAS 3.0軟件進行處理，獲得的藥代動力學參數如下：比格犬靜脈注射1mg/kg的WA后，峰濃度為(1392±120)ng/mL，暴露水平AUC0～t為(925±136)ng/(mL·h)，半衰期t1/2為(14.3±2.4)h，平均駐留時間MRT0-t為(5.8±1.6)h，清除率Cl為(1.1±0.3)L(h·kg)，表觀分布容積Vd為(22.7±4.5)L/kg。比格犬口服灌胃2mg/kg的WA后，達峰時間為0.13h，峰濃度為(179±32)ng/mL，暴露水平AUC0～t為(780±197)ng/(mL·h)，半衰期t1/2為(18±4.6)h，平均駐留時間MRT0～t為(12.6±3.5)h，清除率Cl為(2.6±0.7)L/(h·kg)，表觀分布容積Vd為(67.5±8.9)L/kg。絕對口服生物利用度計算公式為F=[(AUC口服/AUC靜注)×(Dose靜注/Dose口服)]×100%，因此，WA在比格犬的口服生物利用度為(42.2±6.4)%。

3 討論

本研究建立的LC-MS/MS方法可成功地應用于WA在比格犬的藥代動力學研究。經過優化，此方法靈敏度更高，定量下限比報道的更低，有利于更準確分析樣品在體內的消除半衰期[3]。實驗結果表明，WA在比格犬的口服生物利用度較高，吸收較快(給藥后8min達到峰值)。與嚙齒類動物對比，利用已報道的不同實驗室的WA在小鼠的藥代動力學數據，估算小鼠口服生物利用度約為9%，遠低于WA在大型動物比格犬的生物利用度42%，提示WA在大型動物中可能具有更理想的吸收程度[3,7]。此外，WA在比格犬中半衰期較長，有利于藥物長時間在體內發揮藥效。同時表觀分布容積較大，說明藥物可能較多分布在器官組織中。

綜上所述，WA總體上具有良好的藥代動力學性質，可作為口服候選藥物，進行藥物分布、代謝、排泄、安全性等更全面的成藥性評估和臨床前開發，為將來的臨床試驗或最終臨床應用提供參考依據。