一種重組蛋白的表達、純化及應用綜合實驗設計及實踐

李曉玲，李 晨

（山西大學 國家級生物學實驗教學示范中心，山西 太原 030006）

生化分析與技術是一門專業基礎課，其目的是通過教與學使學生熟悉和掌握生物大分子的分離、純化、制備、檢測等技術的基本原理、方法和操作，是一門實驗性很強的課程。通過教學-科研相結合的方式，由科研實驗室提供部分具有探究性質的課題內容作為綜合性實驗項目有利于培養學生的科研能力，并進一步激發學生的創新潛能[1-3]。蛋白質是重要的生物大分子，在組織或細胞中以復雜的混合物形式存在，蛋白質的分離純化是生物化學技術中的重點內容，在科研和生產中都有重要作用。分離純化特定蛋白質的一般程序可分為前處理、粗分級和細分級。細分級一般指多種層析方法，包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析及親和層析等[4]。其中親和層析特異性強，具有高效、迅速的優點，有時僅一步即可達到純化目的。其他層析方法的特異性比較低，通常需要綜合多步操作[5]。為了讓學生熟悉蛋白質分離純化及鑒定流程，充分理解并掌握親和層析方法，在生化分析與技術實驗教學中設計了 “一種重組胰蛋白酶抑制劑的表達、純化及應用” 綜合性實驗項目，內容包括重組胰蛋白酶抑制劑（recombinant trypsin inhibitor，rTI）的制備及純化、親和吸附劑的制備、蛋白活性測定等方法，用到了離心技術、親和層析、凝膠過濾、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）等多項技術。通過該綜合實驗對生物科學及生物技術專業學生進行科研訓練，旨在提高學生科研能力，取得了良好的教學效果。

1 實驗目的

（1）掌握親和層析和凝膠過濾的原理、應用及操作方法。

（2）掌握SDS-PAGE 原理和應用、垂直平板電泳的使用方法。

（3）了解蛋白質固定化技術的概念、種類及應用。

2 實驗原理

2.1 親和層析

某些生物分子間存在特異性的相互作用，能進行專一而又可逆的結合，如酶與底物或抑制劑、抗體與抗原、激素與受體、凝集素與糖等[4]。親和層析就是利用生物大分子對其配體分子的專一性識別能力建立起來的一種純化方法，具有高效、迅速的優點，有時僅需一步即可達到純化目的。將一對能可逆結合和解離生物分子的一方作為配基（也稱為配體），與具有大孔徑的親水性固相載體相偶聯，可制成專一的親和吸附劑。rTI 是胰蛋白酶的一種競爭性抑制劑，具有良好的熱穩定性及酸堿穩定性，可用于制備親和吸附劑用以專一純化胰蛋白酶。本綜合實驗設計了兩次親和層析操作，一是根據重組蛋白上的His×6 標簽，用Ni2+-NTA Agarose 親和柱純化重組胰蛋白酶抑制劑rTI，二是將rTI 固定化做成親和吸附劑特異純化胰蛋白酶。

2.2 凝膠過濾

凝膠過濾是利用具有多孔網狀結構顆粒的分子篩作用，根據被分離樣品中各組分相對分子質量大小的差異進行洗脫分離的一項技術。不同大小的分子由于在凝膠珠中所經歷的路徑不同得以分離，依據分子大小被先后洗脫出來。凝膠過濾可用于分離純化蛋白質、脫鹽及測定蛋白質的相對分子質量。在本實驗中經Ni2+-NAT 親和層析制備的蛋白樣品中含有高濃度的NaCl 和咪唑，因此使用凝膠過濾進行脫鹽及置換緩沖液。

2.3 SDS-PAGE

在進行PAGE 時，蛋白質的遷移率取決于它所帶的凈電荷、分子大小和形狀。十二烷基硫酸鈉SDS 是一種強陰離子型變性劑，引入SDS 后改變了蛋白質分子的天然構象，使大多數蛋白質分子呈同樣的棒狀。同時，SDS 使多肽鏈覆蓋上相同密度的負電荷，掩蓋了不同蛋白質間原有的電荷差別。因此SDS- PAGE 中蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于其相對分子質量，可用于鑒定蛋白質純度及測定蛋白質的相對分子質量。

2.4 固定化技術

最常見的為固定化酶技術，指用物理或化學方法使酶成為不溶于水的但仍具有酶活性的衍生物，不易從載體上流失，易于回收[4]。酶或蛋白質固定化的方法分為物理法（如吸附法和包埋法）和化學法（如交聯法和偶聯法）。相比物理法，化學法固定的酶/蛋白質與載體結合力更強，穩定性更高。其中，溴化氰活化瓊脂糖用于配體固相化簡便廉價，廣泛應用于蛋白質、核酸、凝集素等的固定化。在本實驗中使用溴化氰活化瓊脂糖偶聯rTI，做成親和吸附劑，用以特異純化胰蛋白酶。

3 實驗材料、試劑與儀器

實驗材料：大腸桿菌E.coli BL21（DE3）（含重組表達質粒pQE30-TI，由科研實驗室提供）。

實驗試劑：卡那霉素、NaCl、胰蛋白胨、酵母提取物、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、IPTG、Tris、鹽酸、丙烯酰胺、TEMED、AP、考馬斯亮藍R25、低分子量蛋白Marker、溴化氰活化瓊脂糖等。

實驗儀器：BioRad 蛋白純化系統、恒溫搖床、紫外可見分光光度計、離心機、酸度計、超聲波細胞破碎儀、恒溫水浴鍋、凝膠成像儀、真空冷凍干燥機、蛋白電泳槽、電泳儀等。

層析柱：Ni2+-NTA Agarose 層析柱、Saphadex G25層析柱。

4 實驗方法

4.1 重組胰蛋白酶抑制劑的誘導表達及純化

4.1.1 rTI 的誘導表達

將含有重組質粒的E.coli BL21（DE3）菌種活化并擴大培養，按照1%接菌量接種于1 L 的LB 培養液中（含0.1 mg/mL Kan），37 ℃，180 r/min 恒溫震蕩培養，當菌液在600 nm 處吸光度值達到0.6 時，加入誘導劑IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至終濃度0.5 mmol/L 以誘導重組目的蛋白表達，繼續培養4 h。5 000 r/min 離心10 min 收集菌體，用提取緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗滌菌體兩次，將菌體充分懸浮于100 mL 提取緩沖液中，冰浴中超聲破碎至菌液透亮。超聲破碎條件為180 W，超聲6 s，間歇9 s。超聲破碎后4 ℃，12 000 r/min 離心30 min，收集上清，即為粗品蛋白。

4.1.2 rTI 的純化

用Ni2+-NTA Agarose 層析柱在BioRad 蛋白純化系統上分離目的重組蛋白。用平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.5）充分平衡Ni2+-NTA 層析柱。粗品蛋白經0.45 μm 濾膜過濾后上樣于 Ni2+-NTA 層析柱， 流速設定為1 mL/min。充分洗脫未結合蛋白后，用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，pH 7.5）進行洗脫。收集洗脫峰蛋白，進行SDS-PAGE 分析，用Superdex G-25 脫鹽柱將重組蛋白的緩沖液置換為NaHCO3溶液（20 mmol/L，pH 8.0），進一步用真空冷凍干燥機凍干得到rTI 干粉。

4.1.3 rTI 的活性分析

在 2.5 mL 的測活體系中（pH 7.5，0.1 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L 的 CaCl2），加入0.25 mL 胰蛋白酶（40 μg/mL）和50 μL 的rTI，37 ℃保溫5 min，加入17 μL 底物 BApNA（0.15 mol/L），保溫反應10 min 后，加 0.5 mL 33%醋酸溶液終止反應。在410 nm 下測定吸光值，按照下式計算抑制率。對照組以相同體積的Tris-HCl 緩沖液代替抑制劑溶液[6]。

抑制率=(A1-A2)/A1×100%.

其中，A1和A2分別為對照組和樣品組在410 nm 處的吸光度值。

改變抑制劑體積，分別測定10、20、30、40、50 μL rTI 的抑制率，以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制活性曲線，并計算rTI 的半抑制濃度IC50 值。

4.1.4 SDS-PAGE 電泳檢測

以低分子量蛋白質Marker（14.4～97.4 kDa）為對照，采用 4%和 15%濃縮膠。將純化后的 rTI 和6×SDS-PAGE 樣品緩沖液以5∶1 的比例進行混合，在沸水中煮沸3 min，點樣后進行電泳[7]。電泳時濃縮膠和分離膠電壓分別設置為80 和100 V。電泳結束后，將濃縮膠去除，分離膠放在玻璃皿中，在脫色搖床上用考馬斯亮藍染色液染色1 h，換成脫色液脫色至分離膠背景清晰，然后在凝膠成像系統中拍照記錄。

4.2 重組胰蛋白酶抑制劑的應用

4.2.1 rTI-Agarose 的制備

用碳酸鈉緩沖液（250 mmol/L，pH 9.0）溶解rTI，并調整蛋白濃度為5 mg/mL。用去離子水清洗溴化氰活化瓊脂糖凝膠表面的溶劑后，繼續用碳酸鈉緩沖液浸泡并洗滌。將凝膠與rTI 溶液混合，在搖床上振蕩，25 ℃偶聯6 h。然后加入Tris-HCl 緩沖液（250 mmol/L，pH 8.3），繼續反應6 h 封閉剩余的活性基團。將偶聯了rTI 的凝膠填料裝于柱中，分別用1 mol/L NaCl 溶液和蒸餾水清洗10 個柱床體積，置于4 ℃保存備用。

4.2.2 rTI-Agarose 用于純化胰蛋白酶

取100 μL 30 mg/mL 胰蛋白酶與250 μL 5 mg/mL牛血清白蛋白溶液低溫混合后迅速上樣于 rTIAgarose 親和層析柱， 平衡緩沖液為 Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，pH 7.2，流速控制為1 mL/min。上樣并充分洗去未結合蛋白后，用pH 3.5的HAc-NaAc 緩沖液（100 mmol/L）洗脫層析柱。分別收集穿透峰與pH 3.5 緩沖液洗脫峰，測定各蛋白峰胰蛋白酶活性，并進行SDS-PAGE 鑒定。

5 實驗結果與討論

5.1 rTI 的分離純化

用Ni2+-NTA 親和層析柱純化目的蛋白，結果見圖1。通過對各蛋白峰抑制活性測定發現蛋白峰1 和2無抑制活性，而蛋白峰3（含300 mmol/L 咪唑的洗脫液）抑制胰蛋白酶活性很強，為目的重組蛋白rTI。

圖1 親和層析分離rTI

親和層析純化得到的蛋白中含有很高濃度的鹽（主要為咪唑和氯化鈉），為了避免影響后續實驗，采用了Superdex G25 層析柱對蛋白進行脫鹽（圖2）。在圖2 中，曲線1 表示280 nm 處的光吸收值，反應蛋白質濃度變化。曲線2 表示離子強度，反應鹽濃度變化。鹽離子為小分子，蛋白質為大分子，因此蛋白質比鹽先洗脫出來，圖中蛋白曲線1 先出現吸收峰。另外，兩條曲線未有重疊，完全分開，說明rTI 與鹽得到了有效分離。

圖2 凝膠層析對重組蛋白脫鹽

5.2 SDS-PAGE 鑒定rTI

以低分子量蛋白質Marker（14.4～97.4 kDa）為參照，將Superdex G-25 脫鹽后的重組蛋白rTI 進行SDS-PAGE 鑒定，結果見圖3。rTI（泳道2）在電泳圖譜上顯示單一條帶，表明所得蛋白純度較高，達到電泳純。同時也表明親和層析是種很高效的純化方法，僅需一次層析便得到了高純度的目的蛋白。

圖3 rTI 的SDS-PAGE 電泳圖譜

5.3 rTI 對胰蛋白酶的抑制作用

由圖4 可知，固定胰蛋白酶濃度后，隨著rTI 濃度增加對胰蛋白酶的抑制作用逐漸增強。當rTI 濃度為4.08 mmol/L 時對胰蛋白的抑制率達到50%。rTI對胰蛋白酶的半抑制濃度比較低，表明其對胰蛋白酶具有較強的抑制作用。rTI 對胰蛋白酶的半抑制濃度與從豆科植物補骨脂種子中純化出的一種胰蛋白酶抑制劑（P.corylifoliatrypsin inhibitor，PCTI）類似[8]。后者相對分子質量約為18 kDa，對胰蛋白酶的半抑制率為3.36 mmol/L。

圖4 rTI 抑制胰蛋白酶活性分析

5.4 rTI-瓊脂糖凝膠對胰蛋白酶的純化作用

將胰蛋白酶與牛血清白蛋白混合樣品上樣于rTI-瓊脂糖凝膠親和層析柱，在pH 7.2 的平衡緩沖液條件下上樣，用pH 3.5 的緩沖液洗脫，層析圖譜見圖5。上樣與洗脫時均出現了蛋白峰，表明有一種蛋白在pH 7.2 緩沖液的條件下未與親和柱結合，另一種蛋白在此條件下與親和柱結合，但在pH 3.5 緩沖液條件下與柱解離，被洗脫出來。對2 個蛋白峰進行胰蛋白酶活性鑒定，發現穿透峰沒有胰蛋白酶活性，而洗脫峰有活性，表明穿透峰為牛血清白蛋白，沒有胰蛋白酶，則胰蛋白酶全部結合到親和柱上。SDS-PAGE 結果（圖6）顯示洗脫樣品胰蛋白酶為單一條帶，穿透峰中只有牛血清白蛋白，進一步說明rTI-Sepharose 柱可以特異結合胰蛋白酶。

圖5 胰蛋白酶與牛血清白蛋白在rTI-瓊脂糖凝膠柱上的層析圖

圖6 親和層析蛋白峰的SDS-PAGE 圖譜（泳道1 和2 分別為峰1 和峰2 蛋白樣品）

6 綜合性實驗的實踐體會

6.1 教學組織

生化分析與技術開設在生物化學課程之后，是基礎實驗課的拓展和提升。雖然在生物化學課中已學習了層析、電泳、離心等技術的基本理論和操作技能，但本綜合實驗具有一定的探究性，需要給學生留出時間查閱文獻并提出實驗方案，與老師探討確定方案后自主實驗，因此本實驗課安排在學期的中期進行。為保證教學效果，學生分小組進行，每組人數控制在4人，集中在8 周內完成。在8 周教學時間內，實驗室對外開放，學生可以自主合理安排實驗時間。本實驗的最終成果要求分別以科研論文和PPT 形式展示，在實驗完成后一周進行集中研討課。

6.2 教學效果

6.2.1 驗證性實驗與綜合性實驗優勢互補，提高學生對知識的應用能力

驗證性實驗可規范和培養學生的基本實驗技能，在印證理論知識上的作用不可替代[9]。然而，傳統實驗存在內容簡單、結果顯而易見、內容與生產實際結合不夠緊密等問題[10]。綜合性實驗則是在驗證性實驗基礎上的提升，旨在提高學生綜合應用知識的能力、創新能力及研究能力[11]。本實驗的研究對象是一種重組蛋白，將其作為配體制備了親和吸附劑，用親和層析的方法制備一種蛋白酶。該酶廣泛應用于食品、醫藥、畜牧和現代生物技術等領域，是目前應用最廣的蛋白酶之一[12]。本實驗融合了驗證性實驗和綜合性實驗內容，將二者的優勢實現了有效互補，注重培養學生對知識的應用能力，同時也有利于激發學生的科研興趣。

6.2.2 采用多種教學方式，提高學生綜合能力

（1）培養學生獨立思考能力。老師在介紹實驗背景并提出實驗任務后，需要學生在查閱調研文獻的基礎上，設計出實驗技術方案，經與老師探討后獨立完成實驗。在此過程中，有助于培養學生的自學能力及獨立思考問題的能力。

（2）注重問題引導，培養學生提出問題和解決問題的能力。結合本實驗內容，老師可進一步引導式提問，如在使用原核表達系統表達重組融合蛋白時，不同的誘導條件對蛋白的表達影響很大，如何設計實驗優化誘導表達條件？本實驗用親和層析方法純化胰蛋白酶，工業上傳統純化工藝是什么？兩種方法各有何利弊？酶（蛋白質）固定化方法有哪些？各有什么特點？通過提出問題，以點帶面，有助于學生觸類旁通，對相關內容形成自己的知識體系。

（3）通過多種成果展示，培養學生綜合素質。本實驗結果要求學生以科研論文形式呈現。通過撰寫科研論文鍛煉學生閱讀文獻、規范寫作及分析問題的能力，使學生對所學知識有更全面深刻的認識和理解。在最后的集中探討課上，學生以PPT 形式交流實驗結果，通過PPT 展示鍛煉學生交流及表達能力，使學生能夠科學條理地描述問題，準確表達自己的觀點，初步培養學生的應變及思辨能力[13]。有能力的同學可講解英語文獻，有助于提高學生的專業英語水平。

7 結語

“一種重組蛋白的表達、純化及應用” 這個綜合性實驗項目將教學與科研緊密結合，學生對選題很感興趣，激發了學生的求知欲。通過文獻調研，學生對重組蛋白、層析、電泳、固定化等概念有了較全面的學習和鞏固。在教學實踐中深入了解科研內容，將傳統驗證性實驗與綜合性實驗的優勢進行互補，充分利用研究項目等資源提高本科教學質量，培養學生對知識的綜合運用能力。在整個教學過程中老師僅僅起幫助及把控的輔助角色，學生需要自行查閱文獻，制定計劃方案，分析討論實驗結果，完成科研論文撰寫，對實驗做到了知其然并知其所以然，充分鍛煉了學生的自主學習能力，提高了學生的綜合科研素質[14]。