不同濃度氯化鉀對小鼠海馬神經元膜電位的影響

劉愛麗，諶 輝

（天津醫科大學 生物醫學工程與技術學院，天津 300070）

由于細胞膜兩側離子的不均勻分布，導致膜兩側存在一定的電位差， 稱為膜電位（ membrane potential）[1]。細胞未接收刺激時處于非興奮狀態下的膜電位為靜息膜電位（resting membrane potential，RMP）[1-2]。靜息膜電位對細胞維持良好的功能狀態起關鍵調控作用，如細胞增殖、分化、遷移以及發育和再生過程中的形態形成等，具有重要生物學意義[3-7]。當膜電位比靜息膜電位變得更正時，細胞發生去極化；如果變得更負，則稱為超級化[8]。有研究發現膜電位與多種病理生理狀態（腫瘤、發育障礙等）有密切關系[4,9]。因此，對細胞膜電位的研究至關重要。本文利用膜片鉗技術，記錄4 種氯化鉀濃度下小鼠海馬神經元膜電位的變化以及動作電位特性的改變。研究不同濃度氯化鉀對神經元膜電位和動作電位的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4～6 周齡SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠，購于北京軍事醫學科學院實驗動物中心。小鼠在12 h/12 h 晝/夜循環的室溫（21～24 ℃）環境下分籠飼養，自由飲食取水。實驗過程中對動物的處理均符合動物倫理學標準。

1.2 溶液配置

（1）人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF，mmol/L）：2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgSO4、120 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、26 mmol/L NaHCO3、10 mmol/L Glucose，pH=7.4～7.6，用HCl 和NaOH 調節pH 值。

（2）電極內液（mmol/L）：150 mmol/L Kalium-D-gluconat、10 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、0.25 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgATP，pH=7.2，用KOH調節pH 值。

（3）氯化鉀溶液：1 mol/L。

以上試劑中Kalium-D-gluconat、HEPES、EGTA、MgATP 購于Sigma 公司，其他均為國產分析純。

1.3 小鼠海馬腦片的制備

將小鼠快速斷頭取腦，置于充滿混合氧（95% O2+5% CO2）的0～4 ℃人工腦脊液中冷凍1～2 min，取出放置于冷凍手術臺上進行修塊，然后用膠水將腦組織固定于全自動震蕩切片機（VT1200S，Leica）上，切成350 μm 厚度的腦片。將腦片轉移到32 ℃人工腦脊液中孵育1 h 后于室溫條件下繼續孵育，整個孵育過程中持續通混合氧（95% O2+5% CO2）。孵育完成后，將腦片置于記錄浴槽中，在正置顯微鏡（BX51WI，Olympus）下挑選表面光滑、輪廓清晰的海馬CA1 錐體神經元進行全細胞膜片鉗記錄[10]。

1.4 全細胞膜片鉗記錄

實驗中所用電極由水平拉制儀（Sutter P-97）拉制， 入液電阻為 3～5 MΩ 。 利用膜片鉗放大器（MuitiClamp700B）和數模轉換器（Digidata 1440）采集記錄信號，并在Clampex 10.7 軟件上設置相應的Protocol 并采集數據，采樣頻率為10 kHz，低通濾波為2 kHz。神經元與電極形成高阻（＞2 GΩ）封接之后，給予負壓破膜形成全細胞模式，將串聯電阻和膜電容補償到60%～80%，利用P/4 漏減刺激脈沖進行實時漏減。補償后將電壓鉗模式轉換成電流鉗模式，記錄神經元膜電位。整個記錄過程在室溫（21～25 ℃）下進行。

1.5 數據處理與分析

所得實驗數據均利用軟件pCLAMP Clampfit 10.7和Graphpad Prism 6.02 處理實驗數據，采用t-test 進行統計學分析并作圖，數據結果用Mean±SEM 來表示。統計學水平為0.05（*P＜0.05，**P＜0.01 有顯著統計學差異）。

2 實驗結果與分析

2.1 氯化鉀對海馬神經元膜電位的影響

電流鉗模式下記錄小鼠海馬CA1 錐體神經元靜息膜電位，待記錄基線穩定后，依次加入1 mol/L 氯化鉀溶液將記錄浴液中的 K+濃度增加到 5、7.5、10 mmol/L，并持續記錄膜電位的變化。如圖1 所示，神經元靜息膜電位為-64.42±0.36 mV（N=10）。同時，實驗發現氯化鉀會刺激神經元，使膜電位發生去極化。隨著氯化鉀濃度的升高，膜電位持續去極化，分別為：-58.5±0.33 mV（N=8），-51.79±0.45 mV（N=10），-44.00± 0.65 mV（N=10）。

圖1 不同濃度氯化鉀對海馬神經元膜電位的影響

2.2 氯化鉀對海馬神經元動作電位的影響

氯化鉀刺激神經元發生膜去極化，使細胞產生興奮性。實驗發現當記錄浴液中K+濃度增加至7.5 mmol/L時，膜電位會達到閾電位從而誘發產生動作電位（action potential，AP），如圖2 所示。圖2(a)為7.5 mmol/L KCl組和10 mmol/L KCl 組的動作電位發放曲線圖，相同時長內10 mmol/L 組誘發動作電位的數量較7.5 mmol/L多。圖2(b)為單個動作電位的波形圖。7.5 和10 mmol/L KCl 誘發動作電位的發放頻率（frequence of AP，Hz）分別為1.556±0.438 3 Hz（N=8）、3.474±0.4931 Hz（N=8），具有統計學差異（P＜0.05，見圖2(c)）。與7.5 mmol/L KCl 相比，10 mmol/L KCl 引起膜電位去極化，海馬神經元興奮性升高。

圖2 不同濃度氯化鉀對海馬神經元動作電位發放頻率的影響

隨后，利用pCLAMP Clampfit 10.7 提取數據，對7.5 和10 mmol/L KCl 誘發動作電位的一些特性進行分析，包括幅值（amplitude of AP）、到達頂峰時長（time to peak amplitude）、最大上升斜率（max rise slope）以及最大下降斜率（max decay slope）等，并作統計學比較（見表1）。如圖3 所示，KCl 濃度分別增加至7.5 和10 mmol/L 時，動作電位的幅值和最大上升斜率均具有顯著性差異（P＜0.01），最大下降斜率也有明顯差異（P＜0.05），而到達頂峰時長沒有統計學差異。實驗發現7.5、10 mmol/L KCl 對動作電位的特性有明顯影響。

表1 不同濃度氯化鉀誘發動作電位特性的數值

圖3 不同濃度氯化鉀對動作電位特性的影響

3 結語

海馬神經元為可興奮性細胞，接受化學刺激或電刺激后膜電位會發生改變。當受到強烈刺激時，膜電位會達到閾電位從而產生動作電位。動作電位是維持神經元興奮性功能的基礎[11-12]。實驗結果表明，氯化鉀會使神經元膜電位發生去極化，神經元興奮性增強。并且隨著濃度的增加，膜電位持續去極化。7.5 mmol/L KCl 可誘發神經元產生動作電位，10 mmol/L KCl 誘發動作電位的頻率增加，興奮性增強。與7.5 mmol/L KCl比較，10 mmol/L KCl 誘發動作電位的幅值明顯減小，最大上升斜率顯著降低，最大下降斜率升高，而到達頂峰時長沒有明顯變化。實驗研究發現，高濃度氯化鉀可誘發神經元產生動作電位，且動作電位的頻率、幅值、上升斜率和下降斜率受氯化鉀濃度影響。