高效液相色譜法測定帶藥骨水泥中硫酸慶大霉素C 組分的含量

李沅，馬金竹（通信作者），王翔宇

天津市醫療器械質量監督檢驗中心 （天津 300384）

骨水泥的主要成分為聚甲基丙烯酸甲酯，使用前分為粉末狀骨水泥聚合體和水劑的甲基丙烯酸甲酯，將兩者進行調和，5～10 min 后聚合成粘性物質。骨水泥在髖膝關節手術中起到固定的作用，為控制關節局部感染，還可使用抗生素類骨水泥。自1970年Buchholz、Engelreecht 等首次將抗生素骨水泥嘗試應用于控制關節感染以來，人們開始認識到這種局部給藥系統的優點，并將其廣泛應用于預防和治療骨科相關感染，尤其是對假體周圍感染的治療取得了很好的效果。

在骨水泥的實際臨床應用中，選擇合理的抗生素是首要問題。目前，應用較多的是慶大霉素、妥布霉素等，其具有抗菌譜廣、耐熱穩定性好、吸收迅速等優點。我們通過對骨水泥中硫酸慶大霉素含量的準確測定，可以對帶藥骨水泥粉體原料、生產攪拌工藝及成品進行質量控制，為臨床應用提供技術支持。

本試驗參考藥典[1]，并在大量試驗的基礎上建立了測定骨水泥中硫酸慶大霉素C 組分含量的高效液相色譜法，該方法具有操作簡單、重現性及穩定性好的優勢，為保證該類產品的質量提供了有價值的質量控制方案。

1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），紫外檢測器，G1316A 型色譜工作站；帶藥骨水泥（深圳市漢強醫用材料有限公司），乙腈（為色譜純，天津渤化化學試劑有限公司），氯甲酸-9-芴基甲酯（Fmoc-Cl） （為分析純，SIGMA），甘氨酸（為分析純，SIGMA），硼砂（Na2B4O7·10H2O） （為分析純，SIGMA），氫氧化鈉（為分析純，天津渤化化學試劑有限公司），硫酸慶大霉素工作標準品（MACKLIN），硫酸新霉素工作標準品（MACKLIN）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×100 mm，4 μm），流動相為乙腈:水（95:5），流速為1.0 ml/min，進樣體積為20 μl，柱溫為25 ℃，紫外檢測器的檢測波長設置為265 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液

準確稱取1.50 g 骨水泥粉體，倒入250 ml 碘量瓶中并加入250.0 g 純化水，然后加入磁性轉子，蓋上瓶蓋，在磁力攪拌臺上高速攪拌30 min，取10 ml 懸浮液在4 000 rmp 的條件下離心6 min，上清液用純化水稀釋4倍，待測。

2.2.2 對照品溶液及標準工作液

精密稱取硫酸慶大霉素20.0 mg 于小燒杯中，加入適量純化水，攪拌至充分溶解，轉移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，配置成2 mg/ml 的母液。

分別精密量取15、50、125、250、500 μl 硫酸慶大霉素母液于10 ml 容量瓶中，流動相定容至刻度，混勻，配置成濃度為3.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/ml 的對照品標準工作液。

2.2.3 新霉素內標液

準確稱取50 mg 硫酸新霉素于小燒杯中，加入適量純化水，攪拌至充分溶解，轉移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，配置成濃度為5 mg/ml 的母液，使用時，將母液用純化水稀釋5倍，配置成工作液。母液和工作液均保存于-20 ℃冰箱中。

2.2.4 一般試劑

（1）0.2 mol/L 硼砂緩沖液（pH=8.0）：稱取1.24 g 硼酸（H3BO3）溶于70 ml 純化水中，使用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調節pH 至8.0，最后用純化水定容至100 ml 容量瓶中，混勻。（2）8 mmol/L Fmoc-Cl 衍生化試劑：稱取207 mg Fmoc-Cl（摩爾質量為258.7 g/mol）于小燒杯中，加入適量乙腈攪拌溶解，轉移至100 ml 容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，于4 ℃環境中避光保存。（3）0.1 mol/L 甘氨酸溶液：稱取75.07 mg 甘氨酸（摩爾質量為75.07 g/mol）于小燒杯中，加入適量純化水攪拌溶解，轉移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，混勻，于4 ℃環境中避光保存。

2.2.5 衍生化處理

準確移取100 μl含硫酸慶大霉素的供試品溶液，依次向其中加入5 μl硫酸新霉素內標液（1 g/L）、100 μl乙腈、100 μl硼砂緩沖液（0.2 mol/L，pH=8.0）、100 μl Fmoc-Cl衍生化試劑（8 mmol/L），旋渦混勻30 s，置于暗處反應15 min后，再加入20 μl甘氨酸（0.1 mol/L），旋渦混勻30 s，反應結束；此外，將標準工作液同樣進行上述衍生化處理。

2.3 方法適用性試驗

依據給定的色譜條件，分別取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液，依次進樣，記錄色譜圖，見圖1～3。硫酸慶大霉素4個組分峰的出峰時間在6～8 min，第1個峰與第2個峰分離度為2.1，第2個峰的理論塔板數為5 338。

2.4 線性關系

取“2.2.5”衍生化處理后的待測液，用0.22 μm 或0.45 μm 的濾頭過濾，按照給定的色譜條件進行測定，記錄內標物及各濃度目標物的色譜峰面積，以目標物與內標物峰面積比（Y）對溶液濃度（X）作標準曲線，求得硫酸慶大霉素4個峰的回歸方程和R2值（表1）。在3～100 μg/ml 范圍內，目標物與內標物峰面積比與目標物濃度呈良好的線性關系。

2.5 重復性試驗

取同一批樣品，按照“2.2.1”和“2.2.5”項下方法平行配制6份待測液，依次進樣，記錄結果并計算含量，6次結果的RSD=1.9%，表明該方法重復性好。

圖1 空白溶液

圖2 對照品溶液

表1 線性結果

2.6 儀器精密性試驗

取一定濃度的樣品溶液連續進樣6次，RSD=0.68%，表明在所選定的色譜條件下，系統穩定，儀器精密性好。

2.7 回收率試驗

取6份已知含量的樣品，分成3組，每組分別加入對照品溶液（100 μg/ml）0.06、0.12、0.18 ml，進行衍生化處理后，進樣測定峰面積。以測得量與樣品含量和加入量比較，計算回收率，結果見表2。測得平均回收率為86.79%，RSD=3.31%（n=6）。

2.8 樣品含量測試

取同一批樣品，按照“2.2.1”和“2.2.5”項下平行配制3份供試品溶液，以每6個分析樣品和一組校正液成一個測試組的方式，分別進樣，記錄峰面積并計算含量[骨水泥標稱含量為19.97 mg/g，含量=檢測濃度×100/（骨水泥重量×標稱含量），此計算濃度和標準校正濃度均為衍生化前]，結果見表3，測量結果均在標稱值的±10%以內。

表2 加標回收試驗結果（n=6）

表3 樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 內標物的選擇

由于硫酸新霉素與硫酸慶大霉素均屬于氨基糖苷類抗生素，結構相似，理化性質（極性、溶解度等）接近，在試驗所設定的色譜條件下與樣品中待測組分可充分分離。采用內標法測量可在一定程度上消除進樣量、儀器不穩定等變化所引起的系統誤差。

3.2 檢測器波長的選擇

將硫酸慶大霉素對照品進行衍生化處理后，采用紫外-可見分光光度計，在240～320 nm 波長范圍內進行掃描，確定待測物質的最大吸收波長為265 nm，并以此作為檢測波長。

3.3 衍生化處理及衍生條件的控制

因硫酸新霉素與硫酸慶大霉素缺乏紫外及熒光吸收，其含量無法用常規紫外或熒光檢測器直接測得，因此需進行衍生化處理后再進行檢測。由于硫酸慶大霉素只在衍生化處理后的較短時間內保持穩定，所以本方法采用Fmoc-Cl 試劑，對樣品進行柱前衍生化后再用高效液相色譜法檢測。

衍生條件也會對試驗結果產生較大的影響。當試劑Fmoc-Cl 濃度為8 mmol/L 時，反應時間在10 min 以上，可得到較高的響應值。在衍生化時，若乙腈不足，會導致Fmoc-Cl 的析出；若乙腈過量，硫酸慶大霉素、硫酸新霉素和硼酸緩沖液會產生沉淀，因此，在衍生化中保持乙腈與水的比例為1:1至關重要。

3.4 穩定性試驗

由于硫酸慶大霉素的衍生化在短時間內穩定，所以本試驗未進行穩定性試驗。為保證測定結果可靠，本試驗采用最多6個分析樣品和3個校正液成一個測試組。

3.5 結果分析

本試驗待測組分有4個色譜峰，應按峰面積加和法計算，此方法更能準確測定硫酸慶大霉素的總量。

3.6 方法優勢

本試驗采用高效液相色譜法對同批3件骨水泥進行測試，結果表明，該方法操作簡單，重復性好。由于對帶藥骨水泥的含量測定方法的國內報道不多，故此研究為保證該產品的質量提供了參考。