圓齒野鴉椿果皮總三萜的提取工藝及其抗腫瘤活性△

姚秋娟，馮翯，王玉啟，范琳俐，金航，黃維，2*，鄒小興*

1.福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350007；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350007；3.福建農林大學 林學院，福建 福州 350007

省沽油科野鴉椿屬的圓齒野鴉椿EuscaphiskonishiiHayata是我國特有的常綠小喬木，主要分布在福建、廣東、海南等東南地區(qū)，喜生于海拔1000 m左右的山谷或疏林中[1-2]。圓齒野鴉椿是福建的民間傳統(tǒng)藥材，其果實溫中理氣，可止痛消腫，常用于治療胃痛、瀉痢、脫肛、睪丸腫痛等[3-4]。其果皮中主要含有三萜[5]、黃酮[6]、酚酸類[5-7]等成分，有抗炎、保肝和抗癌等療效[8-10]。三萜類化合物在自然界中廣泛分布，具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、調血脂[11-14]等活性，開發(fā)前景良好。本研究以超聲波法提取圓齒野鴉椿果皮總三萜，利用響應面法優(yōu)化提取工藝，同時在果皮總三萜抵抗腫瘤活性方面做了考察，為今后圓齒野鴉椿藥用資源開發(fā)和利用研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HERAcell 240i型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma)；UV-2700型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；BS-210S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；BC-W201型恒溫水浴鍋(上海貝凱生物化工設備有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE52CS-2型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Millipore Synergy-UV超純水機(美國密理博公司)；101A-0型數顯式電熱恒溫干燥箱(上海陽興試驗儀器有限公司)；TGL-16C型離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥

RPMI 1640 培養(yǎng)液、DMEM從培養(yǎng)液、青鏈雙抗、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶溶液(Hyclone 公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司，批號：MKBP6836V)；齊墩果酸(阿拉丁公司，批號：11354215)；香草醛、冰乙酸、無水乙醇、二甲基亞砜及其余試劑均為分析純。

圓齒野鴉椿于2018年10月采自福建省邵武市天成巖，經福建農林大學研究員鄒雙全鑒定為省沽油科野鴉椿屬圓齒野鴉椿EuscaphiskonishiiHayata，其果實曬干后分離果皮和種子，將果皮粉碎成粉，并過50目篩備用。

1.3 細胞株

肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549、乳腺癌細胞MCF-7和結腸癌細胞HCT-116均購自上海中科院細胞庫。

2 方法

2.1 圓齒野鴉椿果皮總三萜的提取

稱取圓齒野鴉椿干粉1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，根據實驗設計方案，按不同的液料比和不同體積分數乙醇溶液混合后，加入超聲波容器中，以設定的功率提取相應的時間，獲得不同條件下的圓齒野鴉椿果皮總三萜提取液。

2.2 單因素試驗和響應面試驗

根據條件設計單因素試驗，如液料比10∶1～60∶1、提取時間30～120 min、乙醇體積分數40%～80%、超聲功率100～500 W分別進行試驗，考察上述因素對圓齒野鴉椿果皮總三萜提取率的影響。根據中心組合原理，以四因素三水平響應面設計試驗，用Design-Expert V8.0.6軟件進行優(yōu)化。

2.3 三萜含量測定

齊墩果酸經過105 ℃干燥處理后，稱量20 mg，用無水乙醇溫熱溶解到100 mL的燒杯中，冷卻至常溫，無水乙醇定容于100 mL量瓶。分別加0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL齊墩果酸對照品溶液于6個試管，80 ℃水浴揮干，加0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1 mL高氯酸，60 ℃水浴反應20 min，冰浴10 min后用10 mL冰乙酸稀釋，于波長540 nm處測定吸光度(A)值[14]，獲得標準曲線方程：Y=0.600 1X-0.017 2 (r=0.998 6)，X為齊墩果酸對照品的質量濃度(μg·mL-1)，Y為A540 nm。

2.4 圓齒野鴉椿總三萜的純化

果皮提取物濃縮后利用硅膠柱進行分離純化，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮及三氯甲烷-甲醇進行分離洗脫，以乙酸酐-濃硫酸(Liebermann-Burchard)試劑進行檢測[15]，收集洗脫液進行減壓濃縮和干燥。

2.5 圓齒野鴉椿果皮總三萜抗腫瘤活性測定

2.5.1細胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549、HepG2、HCT-116和MCF-7細胞，A549和HepG2細胞采用DMEM培養(yǎng)基，HCT-116和MCF-7細胞采用RPMI 1640培養(yǎng)液，上述2種培養(yǎng)基中均含有胎牛血清(體積分數為10%)、青霉素(1×105IU·L-1)和鏈霉素(100 mg·L-1)，取對數生長期細胞用于實驗。

2.5.2MTT法測定藥物的半數抑制濃度(IC50) 96孔板中每孔180 μL種5×103個細胞，設置果皮總三萜不同給藥濃度，于37 ℃培養(yǎng)箱48 h后加20 μL的MTT，再培養(yǎng)4 h，加 DMSO溶解甲瓚，在570 nm波長下測A值，按公式(1)計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率=(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)×100%

(1)

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1液料比對總三萜提取率的影響 稱取1.0 g果皮粉末，分別按液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL·g-1加入60%乙醇溶液，在溫度50 ℃和超聲功率300 W的條件下，超聲提取1 h。如圖1 所示，總三萜提取率在液料比為30∶1時達到最大值，當液料比>30∶1時，提取率開始下降，這可能與液料比引起細胞外滲透壓的變化有關。

圖1 液料比對圓齒野鴉椿總三萜提取率的影響

3.1.2提取時間對總三萜提取率的影響 稱取1.0 g果皮粉末，在超聲波功率300 W、液料比30∶1和提取溫度50 ℃的條件下，加入60%乙醇，超聲提取45、60、75、90、105、120 min。如圖2所示，提取時間為75 min時總三萜提取率最大，75 min后總三萜提取率略有下降，可能是因為提取時間過長，超聲波會破壞三萜化合物結構。后續(xù)實驗的提取時間為75 min。

圖2 提取時間對圓齒野鴉椿總三萜提取率的影響

3.1.3乙醇體積分數對總三萜提取率的影響 稱取1.0 g果皮粉末，在液料比為30∶1、提取溫度為50 ℃和超聲波功率為300 W條件下，依次加入體積分數分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，超聲提取75 min。如圖3所示，圓齒野鴉椿果皮總三萜提取率從乙醇體積分數30%～60%時顯著上升，60%和70%的乙醇提取率差異無統(tǒng)計學意義，而80%乙醇提取率略有下降(P<0.05)，可能與圓齒野鴉椿果皮總三萜的極性有關，同時基于溶劑成本考慮，選擇60%乙醇作為下一步圓齒野鴉椿果皮總三萜的提取溶劑。

圖3 乙醇體積分數對圓齒野鴉椿總三萜提取率的影響

3.1.4超聲波功率對總三萜提取率的影響 稱取1.0 g果皮粉末，在液料比為30∶1、提取溫度為50 ℃和提取溶液為60%乙醇的條件下，以250、300、350、400、450、500 W超聲波功率超聲提取75 min。如圖4所示，圓齒野鴉椿果皮總三萜提取率從功率為250～350 W顯著上升，提取率在400 W時達到最高，>400 W提取率開始下降，可能過大的功率會造成總三萜結構的改變。

圖4 超聲波功率對圓齒野鴉椿總三萜提取率的影響

3.2 響應面法優(yōu)化結果和分析

3.2.1回歸模型 擬合以單因素試驗為基礎，結合中心組合設計原理，將液料比(A)、提取時間(B)、乙醇體積分數(C)、超聲波功率(D)設為自變量，因變量(Y)為圓齒野鴉椿果皮總三萜提取率，用代碼-1、0、1來表示每個因素的3個水平(見表1)，結果見表2。

表1 響應曲面試驗設計因素水平

表2 響應面分析方案及結果

采用Design-Expert V8.0.6軟件對表2的數據進行響應面分析，以圓齒野鴉椿總三萜提取率為響應值，對各因素進行線性模型擬合，得到多元二次回歸模型方程：Y=9.63+0.17A-0.097B-0.030C-0.053D-0.41AB-0.25AC+0.23AD+0.85BC+0.43BD-0.048CD-0.70A2-0.72B2-0.61C2-0.16D2(r=0.984 2)。通過二次模型及其回歸系數的方差分析來檢驗該模型的有效性，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析

該模型P<0.000 1，失擬項P=0.923 4>0.05，表明模型與實際擬合較好，可以用來預測果皮總三萜提取率并優(yōu)化其提取工藝。由F值可得出各因素實驗結果的影響力為液料比>提取時間>超聲波功率>乙醇體積分數。

3.2.2響應面工藝優(yōu)化分析 從A、B、C、D的交互作用響應面的陡峭情況可以看出AB、AC、BC三者的相互作用對圓齒野鴉椿總三萜提取率均具有較大影響(見圖5)。通過Design Expert V8.0.6分析圓齒野鴉椿果皮總三萜最佳工藝條件為液料比34.91∶1，提取時間為70.16 min，乙醇體積分數為66.73%，超聲功率為378.10 W，該條件下總三萜提取率達到9.63%。根據實驗條件調整，將液料比35∶1、提取時間70 min、乙醇體積分數67%和超聲功率為400 W確定為最佳工藝提取條件。進行3次驗證實驗后，得到圓齒野鴉椿果皮總三萜提取率平均值為(9.63±0.06)%，與理論值一致且重復性好，說明此響應面法得出的回歸模型較可靠。

圖5 兩因素相互作用對圓齒野鴉椿果皮總三萜提取率的響應面圖

3.3 圓齒野鴉椿果皮總三萜的抗腫瘤活性

果皮提取物濃縮后利用硅膠柱分離純化和濃縮干燥，得到圓齒野鴉椿果皮總三萜。用DMSO溶解總三萜后，用不含血清的培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度，分別處理HepG2、A549、HCT-116和MCF-7細胞48 h，MTT法測細胞存活率并作細胞生長抑制率圖，采用SPSS 22.0軟件求出圓齒野鴉椿果皮總三萜的IC50。結果表明，圓齒野鴉椿果皮總三萜對HepG2、A549、HCT-116和MCF-7均有明顯的增殖抑制作用，其IC50分別為(90.38±0.96)、(87.56±1.35)、(86.95±1.64)、(97.30±1.27)μg·mL-1，體現了良好的抗腫瘤活性，見圖6。

圖6 圓齒野鴉椿總三萜對腫瘤細胞增殖的影響

4 討論

響應面法結合多元二次回歸方程擬合各因素與響應值間的函數關系，建立多維空間曲面，通過評價生物影響因子及其交互作用得出最佳水平，這是高效的統(tǒng)計學方法[15]。本實驗以單因素考察為基礎，利用響應面法優(yōu)化了總三萜的提取工藝，并確定液料比35∶1、提取時間70 min、乙醇體積分數67%和超聲功率為400 W為最佳提取工藝條件，此條件下得到的理論提取物中總三萜提取率為9.63%，并進行了3次驗證，得到圓齒野鴉椿果皮總三萜提取率平均值為(9.63±0.06)%，與理論值一致，說明響應面法優(yōu)化得出的提取工藝有一定參考價值。

惡性腫瘤極大地威脅了人類的健康，所以尋找有效治療抗腫瘤藥物是世界醫(yī)學研究面臨的重要課題。近年來，一些傳統(tǒng)的藥用植物在腫瘤預防和治療中顯示了良好的療效，這讓人們開始去關注和了解[16]。三萜類在植物中普遍存在，有很強藥理活性，屬于次級代謝產物，可應用在抗腫瘤藥物的開發(fā)和利用[17-19]。課題組在前期研究中發(fā)現，圓齒野鴉椿果皮醇提物治療惡性腫瘤有一定效果[9]，但其中的抗腫瘤活性成分還未進行進一步的分析。本研究通過對圓齒野鴉椿果皮總三萜進行制備和抗腫瘤活性評價，其結果顯示，圓齒野鴉椿果皮總三萜對肝癌、肺癌、結腸癌和乳腺癌等多種腫瘤細胞均具有良好的增殖抑制活性，有較好的開發(fā)應用前景。