基于生物信息學的青藤堿治療類風濕關節炎作用機制研究△

尚昱志，韋露秋，陳秋霞，唐秀松，方剛，張青槐，黃安，龐宇舟

廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200

類風濕關節炎(RA)是一種以侵蝕性關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病[1]。RA的全球患病率約為0.5%～1%[2]，在中國患病率約為0.42%[3]。其病理過程所致的關節損害、畸形無法逆轉，相關研究顯示RA患者病程在5～10年的致殘率為60%，病程達30年的患者致殘率高達90%[4-5]。RA的發病機制目前尚不明確，亦缺少可根治RA的藥物，醫學界仍在探索高效安全的RA治療藥物[6-7]。

網絡藥理學是生物信息學衍生出的新興學科，強調了將生物學網絡與藥物作用網絡整合[8]。反向分子對接技術是通過計算機將化學分子與蛋白質數據庫自動對接來尋找潛在蛋白質靶標的技術[9]，以改善藥物發現和藥物設計過程，從而解決未滿足的醫療需求[10]。近年來，反向分子對接技術、網絡藥理學等生物信息學技術已較廣泛用于中藥單體、單藥及復方的作用機制研究[11]。

青風藤具有祛風除濕、通經活絡的功效，周仲瑛、李濟仁、劉祖貽等國醫大師均擅用其治療RA[12-14]。青藤堿(sinomenine，SN)是從青風藤中提取生物堿，相關研究表明其具有免疫抑制、抗炎等作用，現已用于RA的臨床治療[15-16]，但從系統生物學整體層面對SN治療RA作用機制研究仍較缺乏。因此，本研究運用生物信息學對SN治療RA的作用機制進行探索分析。

1 材料與方法

1.1 SN可藥性評估

TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)是融合了藥物化學、藥代動力學等信息的中藥研究分析平臺，并提供了藥物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)等相關屬性供可藥性評估[17]。在TCMSP平臺中檢索“sinomenine”，獲取SN的mol2格式文件及ADME相關屬性。

1.2 反向分子對接預測SN潛在靶點

DRAR-CPI (http：//cpi.bio-x.cn/drar/)是可用于反向分子對接的服務器，通過藥物與蛋白質的相互作用預測化合物的潛在靶標，對接分數Z′-score越小，表示化合物和靶點的結合越牢固，當Z′-score<-0.5時化合物與靶點有潛在結合的可能[18-19]。將SN的mol2格式文件上傳至DRAR-CPI服務器進行反向分子對接，將對接獲得的Z′-score<-0.5的靶蛋白確定為納入本研究的SN潛在靶點。

1.3 RA疾病靶點獲取

DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)是整合了包括CTD、UniProt、HPO等數據庫資源的人類疾病相關基因和變異信息數據的綜合平臺[20]，應用DisGeNET數據庫獲取RA疾病基因靶標。

1.4 靶點名稱規范

利用UniProt[21](https：//www.uniprot.org/)中ID映射功能，物種設置為“人”，將Gene Symbol、PDB ID等多種基因、蛋白名稱以UniProt ID為標準進行映射，對映射結果進行人工確認、整理。

1.5 SN治療RA潛在靶點獲取

運用Diagram平臺(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將SN潛在靶點與RA疾病靶點作交集，取共同作用靶標即SN治療RA潛在靶點。

1.6 SN治療RA潛在靶點的相互關系網絡構建及hub靶點篩選

在GeneMANIA(http：//www.genemania.org/)[22]中限定物種為“人”，將SN治療RA的47個潛在靶點輸入進行相互關系網絡構建并篩選出hub靶點。

1.7 GO和KEGG通路富集分析

GO主要用于分析基因產物的生物學過程、細胞組分和分子功能[23]。以Ensembl(http：//www.ensembl.org/)數據庫[24]中的GRC38.P5為GO背景基因文件，將SN治療RA的潛在靶點導入Omicshare平臺(http：//www.omicshare.com/)中的動態GO富集分析工具進行分析及柱狀圖繪制。

KEGG(https：//www.genome.jp/kegg/)是整合了基因組、疾病信息等的綜合數據庫，其KEGG通路圖對已完成測序的基因組進行生物學解釋，被廣泛用于分析基因組學、代謝組學等數據[25]。將SN治療RA的潛在靶點信息導入KOBAS 3.0(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)[26]獲取顯著富集的KEGG通路，并將相關結果導入Omicshare平臺中繪制通路散點圖。

2 結果

2.1 SN的ADME相關屬性

SN的相對分子質量(MW)為329.43，正辛醇與水之間的分配系數(AlgP)為1.32，極性表面積(TPSA)為5.9 nm2，結構中的氫鍵給體(Hdon)和氫鍵受體(Hacc)數分別為1和5，口服生物利用度(OB)為30.98%，Caco-2通透性(Caco-2)為0.62，血腦屏障通透性(BBB)為0.43 nm·s-1，類藥性(DL)為0.46，允許圍繞自身自由旋轉的鍵數(RBN)為2，藥物半衰期(HL)為1.79 h。

2.2 SN治療RA的潛在靶點

通過DRAR-CPI服務器進行反向分子對接預測出SN的靶點蛋白345個，其中Z′-score<-0.5的靶蛋白131個納入本研究。在DisGeNET檢索獲得的RA疾病相關靶點1818個。將SN與RA的靶蛋白作交集(見圖1)，得到SN治療RA的潛靶點47個(見表1)。

表1 SN治療RA的潛在靶點信息

圖1 SN與RA靶點交集

2.3 SN治療RA潛在靶點的相互關系網絡

除去1個暫未發現與其它基因相互聯系的靶點，其余46個SN治療RA的潛在靶點相互關系網絡見圖2。網絡中節點的自由度越高，即該節點關聯其他節點數量越多[27]，圖2網絡中節點的平均自由度約為16，節點的大小與其自由度成正比，自由度大于平均自由度2倍以上的節點認為是該網絡的hub節點[28]，即腫瘤蛋白53(TP53)、蛋白激酶B1(AKT1)、硫氧還蛋白(TXN)為SN治療RA潛在靶點網絡中的hub靶點。

圖2 SN治療RA的潛在靶點相互關系網絡

2.4 富集分析

2.4.1GO富集分析 GO富集結果中包括了16個生物學過程、7個分子功能和10個細胞組分(見圖3)。

圖3 SN治療RA的潛在靶點GO富集

2.4.2KEGG通路富集分析 按P值選取SN治療RA的潛在靶點富集最顯著的前10條通路(見圖4)，圖中縱軸為通路名稱，橫軸富集因子為潛在靶點中屬于該通路的基因的數量與該通路所包含基因的數量的比值。

圖4 SN治療RA潛在靶點的顯著富集的前10條通路

3 討論

不良的ADME是藥物研發晚期失敗的重要原因之一，通過計算機方法可以提高預測和模擬ADME能力，從而簡化和加速藥物研發過程[29]。里賓斯基提出的五規則是是藥物篩選的經典規則，SN的MW、Hdon、Hacc和AlgP均符合里賓斯基的藥物篩選要求[30-31]，且其較高的Caco-2參透性代表具有較高小腸上皮細胞通透性[32]，BBB>0.3 nm·s-1表示對血腦屏障具有強穿透力[33]，TPSA<6 nm2表示滲透細胞膜[34]，DL≥0.18亦符合中藥化合物類藥性的篩選標準[35]，以上SN的理化性質共同反映出其具有良好的可藥性。

近年來，國內外學者對SN治療RA的機制研究主要集中在促炎因子、抗炎因子、基質金屬蛋白酶方面，主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Toll樣受體(TLR)、酪氨酸蛋白激酶/信號轉導子和轉錄激活子(JAK/STAT、RANK/RANKL/OPG)、核轉錄因子-κB(NF-κB)、活化T細胞核轉錄因子(NFATc1)等信號通路等，研究發現SN可能是通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17等促炎因子的表達，上調IL-10、IL-4等抗炎因子，降低基質金屬蛋白酶1(MMP1)、MMP2、MMP3等的表達，進而通過減輕炎癥反應、減少骨破壞、促進組織損傷修復等起到治療RA的作用[36-38]。

本研究通過反向分子對接技術與疾病靶點相映射，預測出SN治療RA的潛在靶點47個，其中IL-10在 RA患者血清中存在異常高表達[39-40]，相關研究證明SN可提高CIA大鼠血清中抗炎細胞因子IL-10的水平[41]，破骨細胞形成是RA骨破壞的重要因素，NF-κB配體的受體激動劑對于破骨細胞形成有重要意義，相關研究表明SN可降低NF-κB配體介導MAPK14的磷酸化[42]，故IL-10、MAPK14根據相關實驗研究可推測作為SN治療靶點，其余45個潛在靶點尚未發現相關的實驗研究。GeneMANIA分析結果(見圖2)提供了靶點間的相互作用信息，在通過GeneMANIA構建的靶點網絡獲得的3個hub靶點中，TP53被認為與RA的成纖維樣滑膜細胞增生和關節破壞相關[43]；AKT1被認為與RA滑膜成纖維細胞生成有關[44]；TXN被認為是RA、系統性紅斑狼瘡等風濕類疾病的差異表達基因[45]，故SN對AKT1、TP53、TXN表達的影響可作為進一步實驗研究重點。

GO富集結果按生物學過程、細胞組件和分子功能以柱狀圖的形式的對基因功能分類情況予直觀展現(見圖3)。在相關潛在靶點顯著富集的前10條通路中(見圖4)，細胞凋亡、TNF信號通路、HIF-1信號通路和Rap1信號通路已有相關研究表明與RA相關[46-49]，但尚未發現SN直接調控該4條通路的相關實驗研究。將這4條通路中包含的SN潛在作用靶點作交集(見圖5)，得到的交集基因的AKT1與預測出hub靶點一致，說明SN很可能作用于AKT1等靶點進而影響這4條通路對RA疾病過程發揮作用。

圖5 SN治療RA的潛在關鍵通路中靶點交集

本研究通過TCMSP評估SN的可藥性，利用反向分子對接技術、網絡藥理學方法預測出了SN治療RA的潛在靶點，構建了靶點間相互關系網絡，并對相關靶點進行GO及KEGG通路富集分析。結果顯示SN具有良好的可藥性，可能通過作用于AKT1、TP53、TXN、IL-10、MAPK14等靶點及細胞凋亡、TNF信號通路、HIF-1信號通路、Rap1信號通路等通路影響RA的疾病過程，為后期相關實驗驗證及臨床應用研究提供了數據支撐。