蟬擬青霉/黃芪雙向發酵菌質化學成分及抗高尿酸血癥活性研究△

王喻淇，劉子菡，王少平，王鵬飛，董凡，代龍，張加余*

1.濱州醫學院 藥學院，山東 煙臺 264000；2.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；3.山西中醫藥大學 藥學院，山西 晉中 030600

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是指由體內嘌呤核苷酸代謝紊亂和(或)尿酸(uric acid，UA)排泄障礙引起血尿酸水平升高的代謝性疾病[1-2]。目前，臨床上治療HUA一般使用別嘌醇片、非布司他、苯溴馬隆等藥物，通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性或促進UA排泄從而發揮降UA的作用。但是，這些藥物在調控UA水平的同時會對其他內源性代謝過程產生不良影響。如苯溴馬隆可導致慢性肝損傷等[3-5]，限制了其臨床應用。目前依然缺乏可以治療HUA的安全有效藥物，因此尋找新的HUA治療藥物具有重要意義。

雙向發酵技術是將藥用真菌與中藥材有機結合的復合型中藥生產工藝。中藥經發酵后可起到減毒(槐耳/烏頭菌質)、增效(槐耳/黃芪菌質)、擴效(槐耳/板藍根菌質)等作用[6-9]。黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao是常用的大宗中藥品種，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[10]。蟬花，亦即蟬擬青霉Paecilomycescicadae，是麥角菌科真菌大蟬草CordycepscicadaeShing寄生于蟬科昆蟲山蟬CicadafiammataDist.若蟲上的子座及若蟲尸體的復合體，是一種具有悠久藥用歷史的名貴真菌，具有很強的免疫調節和抗腫瘤活性[11-12]。鑒于臨床常以補腎健脾、清熱利濕及活血化瘀類中藥治療HUA，本研究取黃芪和蟬擬青霉配伍組合的補脾益腎之功，利用雙向發酵技術優化制備蟬擬青霉/黃芪雙向發酵菌質，闡明菌質中有效成分含量的變化，并采用氧嗪酸鉀鹽誘導大鼠HUA模型，初步評價雙向發酵菌質的抗HUA作用，以期優化黃芪藥效并為臨床治療HUA的新藥研發提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質量220～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 試藥

蟬擬青霉(編號：cfcc81169)由中國林業微生物保藏中心提供；黃芪藥材購于北京本草方源藥業集團有限公司，經北京中醫藥大學張媛副教授鑒定為蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根；氧嗪酸鉀鹽購自美國Sigma公司；苯溴馬隆片(Narcarin)購自德國Excella GmbH公司，批號：1707134；對照品蘆丁(批號：17122001，純度≥98.0%)購于成都曼思特生物科技有限公司；對照品無水葡萄糖(批號：140648-201804，純度≥98.0%)購自中國食品藥品檢定研究院；定標液、質控液和檢測試劑盒購于北京利德曼生化技術有限公司產品；總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒(批號：00110)、三酰甘油(triglyceride，TG)測定試劑盒(批號：112293K)、UA測定試劑盒(批號：00275)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)測定試劑盒(批號：01049)、肌酐(creatinine，CRE)測定試劑盒(批號：04210)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(批號：00612)和天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒(批號：01192)購于北京利德曼生化技術有限公司。

1.3 儀器

CX-4 Pro型全自動生化分析儀(美國Beckman公司)；R200D型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(美國Millipore公司)；BXM-30R 型高壓蒸汽滅菌鍋(西安儀創實驗室儀器設備有限公司)；UV-2000型紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)；FW-100型高速粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；LHS-80HC-Ⅱ型恒溫恒濕培養箱(上海一恒科技有限公司)。

2 方法

2.1 蟬擬青霉/黃芪雙向發酵菌質的制備

2.1.1菌種活化與液體培養 將蟬擬青霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養基上，置于27 ℃、相對濕度80%的恒溫恒濕箱活化培養5 d，備用。用接種環挑取活化后的蟬擬青霉置于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，25 ℃、140 r·min-1的搖床條件下培養7 d備用。

2.1.2雙向發酵菌質的制備 黃芪藥材粉碎后過100目篩。取粉末50 g置于500 mL錐形瓶，加入蒸餾水至250 g混合攪拌均勻，向混合液中添加0.3%纖維素酶和0.3%果膠酶，于50 ℃下酶解90 min，放入121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min，得黃芪提取液；將黃芪提取液冷卻至室溫，接種10 mL蟬擬青霉種子液，在28 ℃、120 r·min-1的搖床條件下培養7 d，即得蟬擬青霉/黃芪雙向發酵菌質。

2.1.3黃芪提取液、雙向發酵菌質中化學成分含量測定 取黃芪提取液、雙向發酵菌質各10 mL，離心后吸取上清液，加入無水乙醇反復傾倒數次，靜置過夜后再次離心，沉淀加入80%無水乙醇混勻，靜置10 min，5500 r·min-1離心5 min(離心半徑10 cm)，棄去上清液，沉淀加水加熱溶解后定容，采用蒽酮-硫酸比色法[13]測定樣品粗多糖和總糖的含量。取黃芪提取液、雙向發酵菌質各10 mL，離心后吸取上清液，采用乙酸乙酯反復萃取，得黃芪提取液、黃芪菌質中的總黃酮，并利用NaNO2-A1(NO3)3比色法[14]測定總黃酮含量。采用酸堿滴定法測定黃芪提取液、雙向發酵菌質中的總酸。每份樣品平行測定3次，取平均值。

2.2 模型制備及給藥

56只SD大鼠按體質量隨機分為對照組、HUA模型組、苯溴馬隆組、黃芪雙向發酵菌質(以下簡稱“菌質”)低劑量組、菌質高劑量組、黃芪低劑量組和黃芪高劑量組，每組8只。動物房適應性飼養1周后用于實驗。各組均給予正常飼料喂養，對照組灌胃給予蒸餾水；其余各組每天灌胃氧嗪酸鉀鹽300 mg·kg-1造模。造模后1 h，陽性對照組灌胃苯溴馬隆20 mg·kg-1，菌質低劑量組和高劑量組分別灌胃給予150、300 mg·kg-1(以黃芪生藥量計)雙向發酵菌質，黃芪低劑量組和高劑量組分別灌胃給予150、300 mg·kg-1(以黃芪生藥量計)黃芪提取液；連續給藥14 d，每天2次，灌胃量均為15 mL·kg-1。

2.3 血清樣品的收集

最后一次給藥后4 h，大鼠進行眼眶靜脈叢取血。血樣于4 ℃靜置過夜，離心取血清，用于生化指標的測定。

2.4 生化指標測定

采用全自動生化分析儀在常規定標、質量控制后，檢測血清中UA、TC、TG、CRE、BUN、ALT及AST水平。

2.5 數據分析

3 結果與討論

3.1 菌質中成分的含量變化

采用無水葡萄糖為對照品，在620 nm處測定吸光度(A)值，以A值(Y)對濃度進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.011 9X+0.002 5(r=0.998 5)。結果表明，與黃芪提取液比較，雙向發酵菌質的總多糖含量明顯增加，為黃芪提取液的1.37倍。采用蘆丁為對照品，在510 nm處測定A值，以A值對濃度進行線性回歸，得回歸方程：Y=13.839X+0.029 7(r=0.999 8)。結果表明，與黃芪提取液比較，雙向發酵菌質總黃酮的含量明顯下降，僅為黃芪提取液的1/3。采用酸堿滴定法，用已知濃度的NaOH溶液滴定黃芪提取液及雙向發酵菌質溶液，結果表明總酸的含量變化并不明顯(見表1)。

表1 黃芪經發酵后成分含量變化 mg·mL-1

3.2 菌質對HUA大鼠血清UA水平的影響

如圖1所示，與對照組比較，氧嗪酸鉀鹽誘導的HUA模型組大鼠血清UA水平顯著升高(P<0.001)，提示模型制備成功。與模型組比較，陽性藥苯溴馬隆組，菌質低、高劑量組及黃芪低、高劑量組均顯著降低了大鼠血清UA水平(P<0.001)。其中，菌質組與黃芪組降UA的作用效果均優于苯溴馬隆組，菌質高劑量組的作用效果最強，優于黃芪高劑量組(P<0.05)，菌質低劑量組與黃芪低劑量組效果無明顯差異。

注：與對照組比較，***P<0.001；與模型組比較，+++P<0.001；與菌質高劑量組比較，#P<0.05。圖1 各組大鼠血清UA水平

3.3 菌質對HUA大鼠血脂指標的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清TC和TG水平顯著升高(P<0.05，P<0.001)。與模型組比較，苯溴馬隆僅能降低血清TG水平(P<0.01)；菌質低、高劑量組及黃芪低、高劑量均能顯著降低模型大鼠血清TC和TG水平(P<0.05，P<0.01)。同時，隨著劑量在一定范圍內的增加，菌質組及黃芪組的調脂作用也隨之增強。

注：與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與模型組比較，+P<0.05，++P<0.01。圖2 各組大鼠血脂指標

3.4 菌質對HUA大鼠腎功能指標的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清BUN水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，菌質低、高劑量及黃芪高劑量均能夠顯著降低模型大鼠血清BUN水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；苯溴馬隆對血清BUN水平無明顯影響。此外，各組大鼠CRE水平無明顯差異。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，+P<0.05，++P<0.01，+++P<0.001。圖3 各組大鼠血清腎功能指標

3.5 菌質對HUA大鼠肝功能指標的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.05，P<0.001)。與模型組比較，菌質高劑量組及黃芪高劑量組均能夠明顯降低大鼠血清ALT和AST水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，且菌質高劑量組藥效作用最強，明顯優于黃芪高劑量組(P<0.05)。而苯溴馬隆組大鼠血清ALT和AST水平均明顯升高，ALT水平甚至高于模型組。

注：與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與模型組比較，+P<0.05，++P<0.01，+++P<0.001；與菌質高劑量組比較，#P<0.05。圖4 各組大鼠血清肝功能指標

4 討論

黃芪可用于治療脾肺氣虛、氣虛自汗、氣血虧虛及氣虛血腫癥。取其健脾之功，可助脾氣升清，運化輸布水谷精微，使水氣輸布得當，減少體內水液停聚，從而降低體內UA水平。以“高尿酸血癥”和“治療”為關鍵詞，選取中醫學、中藥學、中西醫結合條件進行CNKI檢索，并對包含中藥治療的文獻進行藥味統計，結果發現，黃芪用藥頻次為67次，用藥頻率為26.8%，位居第7位[15]。傳統醫學研究發現，HUA所引起的并發癥痛風發病日久，傷及肝脾腎，多用健脾柔肝、補腎固本之品。臨床上常取黃芪益氣補脾、健脾利濕之功，用于HUA的干預治療。現代研究表明，黃芪具有胰島素增敏作用且明顯改善胰島素抵抗對UA的影響[16]。此外，以黃芪為主要藥味的黃芪四妙散[17]、黃芪桂枝五物湯[18]等方劑對HUA具有較好的療效。同樣，蟬花也具有降低血、尿CRE水平，提高內生CRE清除率，改善血清蛋白含量，減少尿蛋白的排出等功效，具有一定的降UA作用[19]，在以蟬花為君藥的蟬花湯延緩慢性腎功能衰竭進展的臨床研究中也發現類似功效[20]?；诖耍狙芯恳韵s擬青霉作為發酵菌株，黃芪作為藥性基質，采用新型雙向液體發酵技術，在一定的優化條件下制備所得的發酵菌質具有顯著的抗HUA活性，為UA治療的新藥研發工作提供了新的思路。

實驗結果表明，菌質中各活性物質水平明顯變化，主要包括多糖類和黃酮類物質。幾種活性成分總量分析結果表明，發酵處理后的菌質中總多糖水平上升，說明蟬擬青霉不斷代謝產生的纖維素酶類物質可破壞黃芪藥材的細胞壁，分解細胞壁中的纖維素、木質素等物質，促進黃芪多糖的溶出[21]；同時，黃芪也促進了蟬擬青霉的生長、分裂和發育，促進其胞外多糖的分泌，從而提高了菌質中多糖的水平。同時，發酵處理后的菌質總黃酮含量下降，其可能的原因是在發酵過程中，蟬擬青霉不僅能合成黃酮類化合物同時還可分解黃酮類化合物，但其分解的速度大于合成的速度，因此導致總黃酮水平下降。

本課題組前期采用UHPLC-LTQ-Orbitrap對比分析了黃芪雙向發酵前后的化學成分，結合色譜保留行為、相對分子質量、碎片離子及相關文獻報道，共分析鑒定了107個化學成分，其中包括42個皂苷和65個黃酮類成分。發酵前后皂苷類成分由42個降至29個，部分皂苷(乙?；蜷L鏈皂苷，如異黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅱ)的含量大幅減少，次生苷或苷元類成分的含量上升明顯；黃酮類成分則由47個上升到52個，部分黃酮苷(如毛蕊異黃酮苷和染料木苷)的含量大幅下降。這表明，苷類在發酵過程中易被代謝成次生苷或苷元，導致極性減小，脂溶性增加，從而提高了其在人體的生物利用度，利于其藥效的發揮[22]，與已知文獻報道相一致[23]，充分體現了中藥發酵可以使其活性成分較大限度釋放的優點。

HUA在我國的發病率呈逐年上升趨勢，是代謝紊亂的重要標志。臨床研究發現，約82%的HUA患者并發高甘油三酯血癥，且發病率呈逐年上升趨勢[24]；在健康人群中血清UA水平與TG水平也呈正相關[25]。本實驗采用灌胃氧嗪酸鉀鹽誘導HUA模型，造模簡單有效。連續灌胃氧嗪酸鉀鹽2周后，模型組大鼠血清中UA、BUN、ALT、AST、TC及TG水平均顯著高于對照組，說明氧嗪酸鉀鹽誘導大鼠產生了HUA模型，并伴隨著高甘油三酯癥和肝腎功能損傷。

血清UA水平是HUA重要的臨床指標，本實驗發現灌胃給予黃芪提取液及蟬擬青霉/黃芪雙向發酵菌質150、300 mg·kg-1能顯著降低模型大鼠血清UA水平，且菌質高劑量降UA作用顯著高于黃芪高劑量，兩者作用效果均強于陽性藥苯溴馬隆。同時，菌質組和黃芪組大鼠血清TC和TG水平顯著降低，減少了高甘油三酯癥患病風險。

血清中的ALT、AST、BUN及CRE水平為衡量肝腎功能的重要指標。本實驗中，大鼠連續灌胃氧嗪酸鉀后，與對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、BUN及CRE水平均顯著升高，說明氧嗪酸鉀鹽誘導大鼠產生了肝腎損傷。研究結果表明，苯溴馬隆雖能夠降低氧嗪酸鉀誘導的大鼠血清UA水平，但對ALT、AST、BUN及CRE水平無影響。而黃芪高劑量及菌質高劑量能夠顯著降低血清ALT、AST及BUN水平，且菌質組作用效果明顯優于黃芪組，尤其是血清AST水平。

基于上述實驗結果，黃芪經蟬擬青霉發酵后所得蟬擬青霉/黃芪雙向發酵菌質對氧嗪酸鉀誘導的HUA模型大鼠血清UA水平具有顯著的降低作用，對模型大鼠血脂水平及肝腎功能具有一定的干預作用，且作用效果優于黃芪單藥。本研究為開發抗HUA中藥新藥、減少HUA并發癥、整體改善機體代謝紊亂狀態提供了依據。