風(fēng)輪菜地上部分1個(gè)新的三萜皂苷△

王揚(yáng)，何樂毅凡，李龍宇，徐明杰，伍一煒，李永勝，褚夏燕，潘巧嶺，趙田甜，葉曉霞，徐暾海*，朱寅荻*，劉銅華

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；3.中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；4.天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津 362700；5.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035

風(fēng)輪菜屬植物約有22種，主要分布在東南亞的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。風(fēng)輪菜Clinopodiumchinense(Benth.) O.Kuntze又名斷血流，最早記載于《救荒本草》[2]，為唇形科風(fēng)輪菜屬植物風(fēng)輪菜的干燥地上部分[3]，是《中華人民共和國藥典》2015年版記載的一種常用的傳統(tǒng)中藥材[4]。風(fēng)輪菜味微苦、澀，性涼，歸肝經(jīng)，具有收斂止血的功效，用于治療崩漏、尿血、鼻血、牙齦出血、創(chuàng)傷出血等各種出血癥，被認(rèn)為是中醫(yī)止血良藥[5]。風(fēng)輪菜中含有黃酮、三萜皂苷[6]、二萜[7]、揮發(fā)油和脂肪酸[8]等類型化合物，這些成分具有抗炎、治療糖尿病[9]、抗氧化、抗腫瘤和抗心肌缺血[10]等活性，其中黃酮和三萜皂苷類化合物是其主要活性成分，具有較好的開發(fā)利用前景。因此，本課題在前期研究基礎(chǔ)上，對風(fēng)輪菜的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從70%乙醇水溶液提取物中分離得到1個(gè)新的三萜皂苷類化合物3β，16β，23，28-四羥基-11α-甲氧基-30-醛基-齊墩果-12(13)-烯-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-巖藻糖苷，命名為風(fēng)輪菜皂苷H(clinopodiside H)。

1 材料

風(fēng)輪菜購買于安徽省亳州市中藥材市場，經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院汪洪副教授鑒定為唇形科風(fēng)輪菜屬植物風(fēng)輪菜C.chinense(Benth.) O.Kuntze。樣品標(biāo)本(20170820)現(xiàn)存于溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振儀(德國Bruker公司)；LTQ-Obit rap XL型質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；YMC Pack ODS-A型半制備色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司)；柱色譜和薄層色譜硅膠(青島海洋化工廠)；D101型大孔樹脂(南開大學(xué))；C18反相填料(日本YMC公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；D-吡喃葡萄糖(批號：110833-201205，純度>99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；D-吡喃巖藻糖(批號：10179351，純度>99%，Alfa Aesar公司)；所用化學(xué)試劑均為分析純(常熟市楊園化工有限公司)；水為實(shí)驗(yàn)室儀器自制超純水(杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司)。

2 提取與分離

風(fēng)輪菜的干燥地上部分用70%乙醇水溶液在80 ℃提取2次，每次2 h，濾過濃縮得到乙醇提取物，加適量水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶劑得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。

取正丁醇萃取物，經(jīng)D101型大孔樹脂分離，用乙醇-水(3∶7、1∶1、7∶3和1∶0)梯度洗脫。取乙醇-水7∶3洗脫部位經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脫，回收溶劑，經(jīng)薄層色譜檢視，合并相似組分得到16個(gè)部位(Fr.Z1～16)。Fr.Z12經(jīng)中壓反相柱色譜，以甲醇-水(3∶7～1∶0)梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢視，合并相似組分得到8個(gè)組分Fr.Z12-1～12-8，將Fr.Z12-6經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜和高效液相制備色譜分離純化，得到化合物1(6 mg)。

3 酸水解

取所分離得到的化合物11 mg溶解于1 mL三氟乙酸-水溶液中，在95 ℃水浴回流2 h。冷卻至室溫，用等體積的二氯甲烷連續(xù)萃取3次。水層減壓濃縮干燥后反復(fù)多次加入無水乙醇旋蒸除去三氟乙酸。與單糖標(biāo)準(zhǔn)品在展開系統(tǒng)(三氯甲烷-甲醇-水8∶5∶1)下層進(jìn)行薄層色譜(TLC)檢測，確定水解得到的單糖種類。用2 mL無水吡啶溶解水層樣品，再加入1.5 mg的L-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽，密封，60 ℃加熱1 h。冷卻至室溫，再加入三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷(1∶2，0.5 mL)，密封，60 ℃加熱30 min。取單糖標(biāo)準(zhǔn)品D-吡喃葡萄糖、D-吡喃巖藻糖(各1 mg)加入1.5 mg的L-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽，用2 mL無水吡啶溶解，密封，60 ℃加熱1 h。再加入三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷(1∶2，0.5 mL)，密封，60 ℃加熱30 min。樣品離心，取上層進(jìn)行氣相色譜分析[11]。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

1H-NMR(CD3OD，600 MHz)譜顯示結(jié)構(gòu)中存在化學(xué)位移為δH0.74，0.97，1.04，1.10，1.35的5個(gè)甲基單峰，1個(gè)雙峰甲基δH1.26(3H，d，J=6.6 Hz)，1個(gè)醛基質(zhì)子δH9.47(1H，s，-CHO)[12]，2個(gè)連氧的亞甲基信號δH3.61，3.86，4個(gè)連氧的次甲基信號。13C-APT(CD3OD，150 MHz)譜顯示化合物共有49個(gè)碳信號，其中包括苷元31個(gè)碳和糖基的18個(gè)碳，苷元部分含有5個(gè)甲基(δC13.3，18.2，18.9，27.0，24.5)、2個(gè)羥甲基(δC68.2，C-28；64.7，C-23)、1個(gè)醛基碳信號(δC208.4，C-30)、2個(gè)烯碳(δC123.9，C-12；148.4，C-13)和1個(gè)連氧次甲基(δC84.4，C-3)。通過該化合物的相對分子質(zhì)量、氫譜和碳譜數(shù)據(jù)分析，推斷其為Δ12-齊墩果烯。通過HMBC和HSQC可知C-16的化學(xué)位移為67.37，連有1個(gè)羥基，H-16和H-27的NOE相關(guān)得到16-OH為β構(gòu)型。HMBC譜顯示H-24與C-3(δC84.4)、C-4(δC44.7)有遠(yuǎn)程相關(guān)，H-12(δH5.52，d，J=3.6 Hz)與C-9(δC53.1)、C-11(δC77.6)、C-13(δC148.4)、C-14(δC44.9)有遠(yuǎn)程相關(guān)，H-23與C-4(δC44.7)、C-5(δC48.4)有遠(yuǎn)程相關(guān)。在HMBC譜中H-3與C-24有遠(yuǎn)程相關(guān)，H-24和H-23都與C-4有相關(guān)，由HMBC和NOESY可知C-24連有甲基，C-23連有羥甲基。該化合物烯碳的化學(xué)位移與齊墩果烷中C-12，13是雙鍵時(shí)化學(xué)位移值相近，故該化合物的烯碳位于12，13位，HMBC中H-12與C-11有相關(guān)，C-11的化學(xué)位移向高場位移，接有1個(gè)含氧基團(tuán)，而且H-11與-OMe的碳有相關(guān)，通過HSQC可知-OMe的化學(xué)位移為δH3.28，與甲氧基的一般化學(xué)位移值接近，且峰形為單峰，故C-11位連有1個(gè)甲氧基。H-3(δH3.61)和H-5(δH1.24)，H-24(δH0.74)和H-25(δH1.10)的NOE相關(guān)得到3-H為β構(gòu)型。H-11(δH3.85)和H-25，H-11和H-26的NOE相關(guān)得到H-11為β構(gòu)型，由此得出苷元為3β，16β，23，28-四羥基-11α-甲氧基-30-醛基-齊墩果-12(13)-烯部分。

化合物1的核磁共振數(shù)據(jù)顯示有3個(gè)糖基，分別是1個(gè)β-D-巖藻糖基和2個(gè)β-D-葡萄糖基，糖的端基碳信號為δC103.6，104.9，105.5(C-1″，1′，1?)，由HSQC實(shí)驗(yàn)確定其對應(yīng)的氫分別是δH4.86(d，J=7.8 Hz)、4.48(d，J=7.8 Hz)、4.60(d，J=7.8 Hz)。HMBC實(shí)驗(yàn)顯示C-3和H-1′、H-1′和C-2′/C-3′、C-2′/C-3″和H-1″、C-3′/C-3?和H-1?之間有遠(yuǎn)程相關(guān)，且C-3的化學(xué)位移向低場位移，說明巖藻糖基的C-1′連接在苷元C-3位上的羥基，2個(gè)葡萄糖基分別連接在巖藻糖基的C-2′和C-3′上的羥基，在COSY譜中H-1″和H-2″、H-1?和H-2?有相關(guān)峰。由端基氫(δH4.48，d，J=7.8 Hz，H-1′)與附近H-2′的偶合常數(shù)確定巖藻糖為β構(gòu)型，2個(gè)葡萄糖的端基氫分別為δH4.86(d，J=7.8 Hz，H-1″)和δH4.60(d，J=7.8 Hz，H-1?)，在NOESY譜中H-1″和H-3″相關(guān)，H-1?和H-1′相關(guān)，確定2個(gè)葡萄糖基為β構(gòu)型。對化合物1進(jìn)行酸水解，用氣相色譜檢測經(jīng)半胱氨酸甲酯鹽酸鹽衍生化和甲基化反應(yīng)的水解的糖部分，并與單糖標(biāo)品比對，進(jìn)一步確證糖的絕對構(gòu)型為D-巖藻糖基和D-葡萄糖基。見圖1～2和表1。

表1 化合物1的1H(600 MHz)和13C(150 MHz)NMR數(shù)據(jù)(CD3OD)

圖1 化合物1的關(guān)鍵COSY和HMBC相關(guān)

綜上所述，化合物1確定為3β，16β，23，28-四羥基-11α-甲氧基-30-醛基-齊墩果-12(13)-烯-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-巖藻糖苷，命名為風(fēng)輪菜皂苷H(clinopodiside H)。

圖2 化合物1的關(guān)鍵NOESY相關(guān)

5 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)對風(fēng)輪菜進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，從75%乙醇水提取物的正丁醇萃取部位分離得到1個(gè)新的三萜皂苷化合物。三萜皂苷類成分是風(fēng)輪菜主要的藥理活性成分。本研究為尋找風(fēng)輪菜屬植物中新的、高效的生物活性成分提供參考。