北方果樹果實細胞壁降解相關酶基因研究進展

劉 琦 王玉霞 李芳東 孫慶田 張福興*

（1煙臺大學生命科學學院，煙臺 264005；2山東省煙臺市農業科學研究院，煙臺 265500）

果實成熟是一個復雜的過程，包含著高度協調的遺傳調控過程。在此過程中伴隨著果實的顏色、質地、氣味的變化，其中果實衰老的一個重要特征就是果實的軟化。有研究表明乙烯是果實衰老的重要激素，尤其是在躍變型的果實中必不可少，關于乙烯在果實成熟軟化中的作用及相關基因也報道頗多。促使果實軟化的主要原因是細胞壁結構發生變化，細胞結構主要依靠細胞壁的支持，細胞壁中的組分發生了分解導致細胞間的結構改變，導致果實軟化。細胞壁組分的變化受細胞壁內的水解酶調控，細胞壁的降解過程有多種酶的參與，例如纖維素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠酯酶（PME）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）等，而這些酶的活性主要是受到基因的控制。

近年來，關于果實軟化，研究細胞壁解體、細胞壁相關酶活性及編碼這些酶的基因成為了主流。本文將與果實軟化有關的細胞壁相關酶基因的研究進展進行綜述，以期為探索果實軟化機理提供理論依據。

1 果實軟化相關酶降解基因研究進展

1.1 果膠酯酶（PME）相關基因

PME是一種催化半乳糖醛殘基中C6羧基族脫甲基的酶，在決定果膠含量中起重要作用。在棗果實中PME基因在脆熟期表達出現了，但到軟化期反而逐漸減少，這說明PME基因具有果實軟化的先導作用。有實驗表明PME的活性是由多個PME基因共同調控表達的，在不同品種的藍莓果實中，不同基因不僅品種間差異較大，而且在不同的發育階段也各不相同，其中調控最為明顯的是PE、PE31、PME3這三個基因。有研究者從杏果實中克隆出一條命名為PaPME1的PME的同源基因，其表達量會受1-MCP和水楊酸的抑制。研究證明桃基因組含有71個PME和30個PMEI基因，它們在8條染色體上分布不均。將71個PME分為36個1型和35個2型PME，這兩類PME基因均在脫甲基酯化反應中發揮作用。在鑒定的30個PMEI基因中，有15個在果實成熟過程中表達于兩種類型的果實中；5個PMEI基因在MF型桃中表達高于SH型桃，表明這些基因與果實成熟有關。1型PMEs的前區可能參與了活性的自抑制，防止在含有果膠的分泌囊泡中運輸期間過早的去酯化。由于2型PMEs缺乏PMEI樣的前區，因此在果實成熟過程中，5種PMEI可能共同表達，以阻斷分泌囊泡內的活性。通過對兩種不同質地桃果實成熟過程中PME和PMEI基因表達譜的分析，研究了3個PMEE和5個PMEI基因的上游調控順式元件與激素反應的關系。一個PME（Prupe.7G192800）和兩個PMEI（Prupe.1G114500 和 Prupe.2G279800）及其啟動子被認為是今后研究果實成熟的生化代謝和調控的潛在靶點。不同的品種基因表達的情況也不同，在桃果實中，PME基因‘沙紅’在貯藏期間其表達量持續增加，特別是貯藏末期，其表達量到達了采摘當天的7 000倍，但在‘秦王’的整個貯藏期間PME表達量都極低。本實驗還證實了乙烯的缺乏會導致PME、PG基因表達受阻，這兩種基因在桃果實軟化中協同發揮作用，且作用于軟化后期。除此之外，草莓果實中也被證明在成熟期PME非常豐富。Cristina Castillejo等人分離出4種不同的草莓PE cDNA，稱為FaPE1至FaPE4。FaPE1在果實中有特異表達，在果實成熟過程中表達量增加，在果實的轉折期達到最大值。在激素調控方面，生長素處理提高了青果中FaPE1的mRNA水平，而外源乙烯處理降低了成熟和衰老果實中FaPE1的mRNA水平。FaPE1表達的抑制可能與果實衰老過程中的結構變化有關。但也有報道稱在蘋果軟化過程中PME家族中沒有一個候選基因受到調控，也沒有明顯的任何去甲基化。

1.2 纖維素酶（Cx）相關基因

Cx的主要功能是分解含1，4-葡萄糖基鏈的半纖維素基質多糖。在棗果實中有2個纖維素合成酶基因在果實成熟前期大量表達，與纖維素的含量呈負相關，并證明了棗果實軟化使纖維素酶各個基因聯合調控的結果。在覆盆子核果軟化過程中纖維素酶活性顯著提高，在成熟的鱷梨、草莓、黑莓、桃子等果實中也發現了類似的變化。成熟樹莓核果中的纖維素酶水平只有鱷梨的0～3%。盡管存在這些相關性，但纖維素酶在果實軟化過程中壁破裂的確切作用尚不清楚。在葡萄柚貯藏的中和后期，Cx的活性上升較快，而且基因的表達量也明顯增加。有研究者認為，Cx在果實軟化過程中可能對PG和PME具有補充的作用。研究者從草莓果實中分離并鑒定出2個不同的EGase cDNA克隆cel1和cel2，在草莓果實成熟過程中，單靠Cel1并不是果實軟化的主要決定因素。轉Cel1基因植株的EGase活性水平可能來自于Cel2或其它具有CMCase活性的細胞壁酶，這些酶的活性沒有降低，從而避免了果實硬度和細胞壁組成的任何變化。另外磷酸三鈉（TSP）處理對果膠甲酯、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活性也有抑制作用，TSP通過調節細胞壁降解酶活性和控制果膠物質，可以延緩棗果實軟化。

1.3 多聚半乳糖醛酸酶（PG）相關基因

最為常見的一種參與果實軟化的水解酶就是PG，植物中的PGs是一個非常龐大的基因家族。PG的主要作用就是半乳糖苷鍵發生水解，令細胞壁結構發生解體，從而使果實軟化。PG基因在不同的植物、不同的時期及不同的組織中表達的模式差異比較大，不同時空的表達由各基因家族成員分別調節。姜妮娜等從柿果實中克隆到PG基因的3個全長cDNA，分別命名為DkPG1-3，結果表明，柿果實中DkPG1基因的表達受乙烯調控，參與PG酶合成，從而調控柿果實的成熟衰老。后有研究者從杏果實中克隆出一條命名為PaPG1的PG基因（PaPG基因是杏果實軟化最明顯的候選基因）并證明了此基因的表達量和PaPME1同樣會受1-MCP和水楊酸抑制，因此，PG基因并非果實軟化的唯一因素。蘋果“長富2”果實在冷藏期間PG的活性以及MdPG1-3基因的表達量都增加了，因此成熟階段多聚半乳糖醛酸酶的活性是由MdPG1、MdPG2、MdPG3共同調控的。有實驗者證明在棗果實中PG基因并非果實軟化的關鍵因子。有實驗表明MPG1和MPG2與桃果實的衰老軟化均有關系。但也有實驗表明僅僅是PG基因不足以引起果實軟化，PG并非唯一引起細胞壁降解的因素。研究表明，UV-C輻射延緩了貯藏草莓成熟過程中的軟化，UV-C輻射處理后的1小時內，草莓軟化的延遲可能是通過降低一組與細胞壁解體有關的FaPG1基因的表達來實現的。因此UV-C處理可以延緩果實的成熟，并保持果實的采后硬度，降低了果實的軟化程度。有研究者控制反義PG基因的劑量，增加反義RNA的表達，并使用反義RNA來增強破壞基因表達的能力。功能性PG活性在正常缺陷和含rin突變的水果中的表達，即使在rin的情況下，可溶性果膠增加，也不會引起軟化。有研究者在獼猴桃分離到了13個新的PG基因，并證明了AdPG1的啟動子與AdBPC2和AdBPC3存在結合和調控效應。另外，在藍莓果實中，不同品種和部位的PG基因的表達情況有所差異，PG（3）在‘奧尼爾’和‘燦爛’兩品種中的表達變化與酶活性時相似的，而PG(1)-(2)基因表達與酶的變化也有一定關系，這表明了酶活性的變化主要受到PG（3）基因的表達的影響，而PG(1)-(2)基因的表達在一定程度上與酶活性的變化也有關系。

1.4 β-半乳糖苷酶（β-Gal）相關基因

β-Gal能從β-半乳聚糖支鏈非還原末端切除β-半乳糖殘基，不但可以降解纖維素和果膠，而且可以降解蛋白和糖脂，令細胞壁的某些組分變得不穩定，從而使細胞壁膨脹，進而使果實發生軟化。研究者以蘋果果實“長富2”為試材證明了β-Gal的作用時期主要是果實成熟后期，MdGAL1、MdGAL2是重要的編碼基因，并且這兩種基因的表達是先于β-Gal活性到達高峰的，這說明酶活性的增加可能是由于基因的表達量的增加。Md-gal表達量隨著蘋果果實發育其基因表達水平顯著升高，且在品種間有顯著差異。另有研究者表明MdbGAL1、Mdb-GAL2和Mda-AF2是蘋果果實軟化的重要遺傳標記，在今后的轉基因和QTL研究中應予以考慮，以更好地了解蘋果果實軟化，尤其是Mdb-GAL2。周厚成等人從草莓果實中分離出了1個 β-Gal基因家族中的 FaTβgal基因，隨著果實成熟，此基因的表達量軟質品種‘豐香’和硬質品種‘甜查理’中均快速增加；在果實完全成熟后，此基因在‘甜查理’中的表達量迅速下降到較低水平，而在‘豐香’中仍保持較高水平，這一結論證明了此基因與草莓果實軟化密切相關。目前有研究者從獼猴桃中克隆到兩個新的 β-Gal基因，分別命名為 AdβGal1和AdβGal2。初期開始，這兩個基因均從通過上調基因表達量來參與獼猴桃果實軟化，以此來提高β-Gal的活性，從而參與果實軟化進程。在桃和香蕉果實中也被證明β-Gal是果實軟化所必需的基因。藍莓果實不同的發育時期，β-Gal16的表達量均在成熟期較高，這時β-Gal的酶活性也較高，這一結果表明β-Gal16基因的表達會影響酶的活性。

1.5 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）相關基因

α-L-Af屬于水解酶家族，可以從含有阿拉伯糖殘基的非還原末端水解成為一個L-阿拉伯糖分子。有研究者從日本梨（Pyrus pyrifolia）果實中分離純化了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arafase），并分離到一個相關的cDNA克隆（PpARF2）根據該酶的表達模式和性質，它是從果實中分離得到的糖苷水解酶家族3的新成員，可能與果實軟化過程中細胞壁結構的改變有關。另有實驗證明，在梨成熟過程中，β-Gal和α-L-Af酶活性的提高及其相關基因的表達表明，它們在與果實成熟相關的細胞壁中起修飾作用，因此β-Gal和α-L-Af可能是梨果實軟化的必要條件。α-L-Af是香蕉果實成熟的特異誘導因子，在果實軟化過程中起重要作用。另外，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（LeARF1）的基因受到乙烯的負調控，乙烯可以控制其在成熟過程中的表達下降和mRNA翻譯或激活α-L-Af原蛋白。實驗證明α-L-Af的基因表達量與果實硬度呈負相關，并且用1-MCP處理能明顯抑制貯藏中后期α-L-Af基因的表達量，尤其是貯藏后期抑制效果尤為明顯。也有實驗表明果實采后使用外源鈣處理可以降低α-L-Af的活性和其基因表達。

2 存在問題及發展前景

果實軟化是果實衰老的一個重要特征，果實軟化主要是因為細胞壁結構的變化，細胞壁相關酶的活性變化會導致細胞壁降解。細胞壁水解酶的活性又會受到基因的調控，其基因的表達量會影響果實軟化。這一點在草莓、柿、桃、藍莓、獼猴桃等果實中已經得到證實。

在果樹果實中 PG、PME、Cx、β-Gal和 α-L-Af基因的表達量對酶活性的影響和果實軟化的作用都有了一定的研究。但仍存在一些問題，目前大多數的研究僅限于對這些細胞壁相關水解酶基因單獨的研究，較少探索它們之間的相互關系及作用等，關于果實軟化的細胞壁相關水解酶基因之間可能存在這相互制約或者相互促進的關系；與果實軟化相關的細胞壁水解酶的不同基因表達的時間和時期各不相同，同一基因在各個果樹果實中的表達時期也不盡相同，尚未見對此有系統性的研究。

未來關于果樹果實軟化細胞壁相關水解酶基因的研究可以從以下幾個方面入手：選擇某一種果樹果實，探究各相關水解酶基因與果實軟化的關系。總結不同成熟度與各個基因表達量的關系；探索新的可抑制各個與果實軟化相關基因的表達量的方法，為果實采摘后保鮮及貯藏提供科學依據；研究與果實軟化相關酶基因之間的相互關系及作用；測量同一果實不同成熟期的基因表達量和同一基因在不同果實成熟時期的基因表達量等；對關鍵基因進行克隆，通過合理的實驗設計來確定基因的功能，探索更多同源基因家族；可以控制反義RNA的表達，并使用反義RNA來增強破壞基因表達的能力，以此來抑制功能基因的表達來控制果實軟化。