抗氧化劑在豬精液冷凍保存中的作用

康樂毅 ，趙俊金 ，鄧曉彬 ，程 晨 ，劉 剛 ，張永紅 ，郭 勇 ，邢 凱 ＊,倪和民 ＊

（1.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2.全國畜牧總站，北京 100193；3.北京田園奧瑞生物科技有限公司，北京 100096；4.中國農業出版社有限公司（數字出版與管理中心），北京 100125）

豬繁殖技術發展趨勢由自然繁殖過渡到鮮精繁殖再到凍精繁殖。與常規液態保存精液相比較，豬的冷凍精液繁殖技術成績并不理想。文內就近幾年應用在豬冷凍精液的新型抗氧化劑進行綜述，完善豬冷凍精液技術的相關研究理論。希望最終加大推廣凍精使用的力度，提高生產效益。

1 豬精子冷凍過程中的氧化損傷

哺乳動物精子細胞具有高度特異的脂質組成，高含量的多不飽和脂肪酸、血漿蛋白原和鞘磷脂。這種不同尋常的精子膜結構決定了它的靈活性和精子細胞的功能能力。然而，精子的脂質是過氧化的主要底物，可能會引起嚴重的精子功能障礙。另一方面，低（生理）水平的脂質過氧化反應反映了活性氧（ROS）對精子代謝的影響，增強了精子與透明帶相互作用的能力[1]。精子膜的病理性脂質過氧化程度較高的一個原因可能是氧化應激失衡。

多不飽和脂肪酸（PUFAs）在精子細胞膜中的過氧化反應是一種自催化、自繁殖的反應，可引起細胞功能障礙。過氧化反應的第一步，稱為起始反應，是從不飽和脂肪酸中提取一個氫原子。第二步增殖是脂質烷基自由基的形成，然后與氧快速反應，形成脂質過氧化自由基。由于過氧自由基和烷基自由基被再生，繁殖循環可以無限期地持續下去，直到自由基反應中某個底物被消耗或終止[2]。

此外，精子膜脂參與配子的相互作用。其中一種是半乳糖基甘油脂質[3]，另一種是溶血磷脂酰膽堿[4]，可刺激精子受精能力，引起透明帶成分的改變，并促進卵膜的精卵融合?？傊挥诰幽ぶ械娜煞謪⑴c調節精子成熟、精子發生、獲能、頂體反應并最終參與膜融合。顯然，精子脂質過氧化也會干擾上述精子的所有功能，極端情況下甚至會完全抑制精子的形成。

過量的自由基產生經常涉及精子發生的錯誤，導致精子從生發上皮釋放，表現出異常高水平的細胞質保留。多余的細胞質中含有酶，為精子的質膜氧化還原系統進一步生成ROS提供燃料。這種氧化應激的后果包括精子喪失運動性和受精潛力，以及誘導精子細胞核的DNA損傷。精子功能的喪失是由于精子原生膜中的不飽和脂肪酸發生過氧化作用，導致精子喪失流動性，細胞喪失功能[5]。

2 抗氧化劑在豬精液冷凍保存中的作用

抗氧化劑的使用可以將氧化損傷的破壞降低，并顯著提高解凍后精子的各項指標。最近幾年，許多研究人員在稀釋液內添加不同的抗氧化劑[6]，證明了抗氧化劑在精液冷凍保存上起到了重要作用。

2.1 芝麻酚

芝麻酚是芝麻油中的重要的香氣成分，是芝麻油的品質穩定劑。易溶于極性有機溶劑，是一種常見的抗氧化劑。

芝麻酚作為承擔抗氧化作用的內活性物質、保護不飽和脂肪酸不被氧化[7]，故芝麻油要比其他植物油更為穩定。在食品領域，添加芝麻酚可延長食品的保存時間[8]，提高油脂的抗氧化能力。在醫學領域中，特別在醫學損傷防護上，芝麻酚也發揮著保護作用。在降低DNA損傷[9]、提高DNA自我損傷修復能力[10-11]效果明顯。

王捷[12]等人通過實驗證實添加適量的芝麻酚可以顯著提高精子解凍后指標以及精子內抗氧化酶活性，添加0.2 g/L的芝麻酚時精液保存效果最好。

2.2 葡萄籽原花青素

葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取出的新型抗氧化劑，同時也是目前為止發現的最強效自由基清除劑[13]。李春陽等人[14]研究發現葡萄籽原花青素的抗氧化、清除自由基的能力隨著純化程度的提高也相應地提高。

孫艷青[15]等人發現添加葡萄籽原花青素對豬精子起到了很好的抗氧化保護能力，最適添加濃度為40 μg/mL，可以顯著降低丙二醛水平，解凍后精液各項指標均得到提升。

2.3 維生素P

維生素P是一種植物次級代謝產物，又名蘆丁、橘皮素等[16]。維生素P具有增強其他維生素功效、防止瘀傷、增強機體對傳染性疾病的抵抗及抗氧化[17]等作用。

維生素P具有心臟保護[18]、抗菌消炎、抗癌、調節毛細血管通透性的作用，臨床上用于治療高血壓、心腦血管疾病等，起到了不錯的治療效果。前人研究表明，維生素P具有清除自由基的功能[19]。夏維木[20]證明維生素P可以清除超氧根離子，并且清除的效率很高。同時維生素P由于結構的特殊性，能夠螯合金屬離子，起到抵抗脂質過氧化的功能，從而保護精子，減少損傷。維生素P作為酮類化合物，其結構與活性之間存在密切的關系?；鶊F的數量和結構都會影響活性[21]。

吳琳[22]研究發現在冷凍保存的過程中，添加0.6 mM的維生素P，可以顯著提高精子的結構完整性，提高抗氧化酶的酶活性，降低有害代謝產物含量。相比較而言，當添加1.0 mM和2.0 mM的維生素P后并沒有明顯提高精子的生理特征，很可能是由于添加高濃度的維生素P使得細胞的滲透壓增大，改變了精子的生存環境。

2.4 α-硫辛酸

α-硫辛酸（Alpha-lipoic acid，ALA）是一種來源于辛酸的有機硫化物，它是一種天然的抗氧化劑，廣泛存在于動物體內，作為許多酶的必須因子來參與機體生化反應。

由于α-硫辛酸是一種天然強抗氧化劑，因此在國際上對于α-硫辛酸的研究從來都未停止過。α-硫辛酸能夠有效降低經高葡萄糖誘導的PC12細胞損傷[22]。Park[23]等研究發現α-硫辛酸可以上調抗凋亡和抗氧化基因的表達，以此可以改善內皮功能紊亂。在α-硫辛酸對精子冷凍保存影響方面，Ma等人[24]研究發現α-硫辛酸能夠提高山羊精子活力及在精子介導的轉基因過程中保護精子不被氧化損傷。

胡曉辰[25]通過實驗證實冷凍基礎液中單獨添加一定濃度的α-硫辛酸和維生素C均能有效提高凍后豬精子總抗氧化能力和抗氧化酶活力；其最佳濃度分別為6.0 mg/L和400 mg/L；聯合添加二者的冷凍保存效果優于單獨添加，其最佳配伍濃度為4.0 mg/Lα-硫辛酸和600 mg/L維生素C。

2.5 中草藥提取物

2.5.1 靈芝多糖

靈芝在我國具有400多年的悠久應用歷史[28]，靈芝屬真菌。靈芝多糖是從靈芝中提取出來具有生物活性的一種物質，其具有調節免疫[29]、抗氧化[30]、抗癌[31]、防衰老、改善睡眠、降低血糖等生理活性[32]。

吳琳[22]通過實驗證實在冷凍精液保存的過程中，添加0.8 mg/mL的靈芝多糖，可以顯著提高精子結構完整性及抗氧化酶活性，但對線粒體活性沒有顯著的增強作用。

由于靈芝多糖是一種大分子的物質，不能夠進入到精子的細胞內部，只能夠在精子細胞的外面進行保護。推測其保護機制可能是在細胞膜的外邊形成一層保護膜，進而使得膜和頂體的完整性提高，但不能夠對線粒體進行保護，同時研究表明當靈芝多糖的濃度過高時，精子的活率開始降低，很可能是由于多糖自身具有黏性，吸附在精子的周圍，從而阻礙了精子的運動，使得活率降低。還可能是因為線粒體是精子運動的能量來源，而靈芝多糖并不能提高線粒體的活性，從而使得精子的運動能力降低，從而導致活力降低[32]。

2.5.2 丹參酮 IIA

丹參酮IIA（TanshinoneⅡA）是唇形科植物丹參的主要提取成分[33-34]。吳琳[22]通過實驗證實在常溫保存中，在豬精子常溫稀釋液中添加0.9 mM的丹參酮IIA，可以顯著提高精子質膜及頂體完整性。在冷凍保存的過程中，在豬精液冷凍稀釋液中添加1.2 mM的丹參酮IIA，可以顯著提高精子質量，顯著降低MDA含量和提高抗氧化酶中SOD酶活性和GSH-Px酶活性，但對質膜的完整性和CAT酶的活性的提升沒有作用。

2.6 其他抗氧化劑

褪黑素是色氨酸的衍生物，主要在松果腺合成和分泌，也存在于哺乳動物的卵巢、睪丸、骨髓、視網膜和晶狀體等多種組織中。褪黑素具有多種重要的生理功能，如控制晝夜節律、誘導睡眠、調節季節性繁殖、增強免疫力和抗氧化作用等。褪黑素最基本的功能被認為是它的抗氧化功能，它可以保護生物體免受氧化損傷。褪黑素也是一種強有力的自由基清除劑，包括可以清除引發脂質過氧化的過氧化物自由基和羥基自由基。

此外維生素C、維生素E、谷胱甘肽及一些內源的超氧化物歧化酶與過氧化氫酶也在精液抗氧化上發揮著作用。由于前人對這些抗氧化劑研究較為深入，故在此不多做介紹。

3 展望

非洲豬瘟形勢下，活體引種和鮮精運輸受限，使用豬凍精配種的豬場正在逐步增加。據報道，豬藍耳病病毒、豬瘟病毒等病毒能通過精液傳播，精液存在垂直傳播病毒的風險；凍精的長時間保存特性可以使人們有充足的時間檢測各種健康指標，杜絕精液垂直傳播疾病的風險；凍精的長距離運輸、長效保存，突破了時空限制，使養豬生產上可實現精準實時選配。隨著未來在新型抗氧化劑探索及抗凍劑稀釋液的優化上研究逐步深入，豬冷凍精液的推廣和使用勢必發展迅速，其解凍后指標也逐漸向鮮精靠攏。