雞傳染性喉氣管炎和新城疫病毒雙重PCR檢測方法的建立

戴娜桑

（福建省南安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 362300）

雞傳染性喉氣管炎 （Avian Infectious Laryngotracheitis，AILT）及雞新城疫(Newcastle disease，ND) 在臨床中有極為接近的表現(xiàn)癥狀的雞呼吸道疾病，對于養(yǎng)殖業(yè)有重大危害，造成大量雞只死亡，造成養(yǎng)殖行業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這兩種病毒的感染性極強(qiáng)、致死率極高，對不能年齡段的雞群造成感染，而雞群感染后的癥狀接近，常出現(xiàn)一種或兩種病源混合感染，給病毒治療和預(yù)防帶來極大困難[1]。本文以雞傳染性喉氣管炎病毒和雞新城疫病毒的基因保守序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行2 對特異性引物及2 條非一致熒光基團(tuán)標(biāo)記的TaqMan 探針設(shè)計(jì)與試驗(yàn)，優(yōu)化和調(diào)整了反應(yīng)條件后，建立雞傳染性喉氣管炎病毒和雞新城疫病毒雙重PCR 檢測方法。

1 材料以及方法

1.1 材料

主要材料包括雞傳染性喉氣管炎病毒LaSola 株、雞新城疫病毒H120 株、禽流感病毒(AIV)、雞白血病病毒(ALV) 等雞類常見病毒，全部由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行保存。以及一步法熒光RT.PCR 反應(yīng)試劑、病毒RNA 抽提試劑盒。

1.2 方法

引物的設(shè)計(jì)及合成：以雞新城疫病毒的NP 基因及雞傳染性喉氣管炎病毒的N 基因保守序列，使用Primer Express3.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，成功設(shè)計(jì)出2 對特異性引物及2 條TaqMan 探針。

敏感性檢測：把質(zhì)粒PAILT 及pNDV.NP 進(jìn)行混合，以10倍稀釋為1×101拷貝/μL～1×107拷貝/μL，以幫助實(shí)施雙重?zé)晒釸T.PCR 實(shí)驗(yàn)，一共進(jìn)行8 次試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果和常規(guī)PCR 檢驗(yàn)對比。

2 結(jié)果

特異性檢測：將cDNA 作為本次特異性實(shí)驗(yàn)的研究模板，其是通過雞新城疫病毒的基因組RNA 的反轉(zhuǎn)性錄入所得出，在模板中添加針對雞新城疫病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒的引物、探針來對其實(shí)施RT.PCR 試驗(yàn)，采集所有檢驗(yàn)孔的FAM 與JOE 信號，通過采集結(jié)果得出這一方法的引物及探針在兩種病毒中的特異性。對雞傳染性喉氣管炎病毒也實(shí)施相同方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

重復(fù)性檢測：用本次所構(gòu)建的雙重PCR 檢驗(yàn)方法對雞新城疫病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、鴨瘟病毒、禽流感病毒、偽狂犬病毒、正常雞胚和正常雞器官進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，確定本次研究構(gòu)建的雙重PCR 檢驗(yàn)方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

樣品試驗(yàn)：本次研究選取了在各個(gè)地區(qū)收集的150 份雞新城疫、雞傳染性喉氣管炎的疑似雞病料，并使用建立的雙重PCR 檢測方法進(jìn)行檢驗(yàn)，對得出的增產(chǎn)物實(shí)施序鑒定，使用生物學(xué)軟件對鑒定結(jié)果進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

靈敏度試驗(yàn)結(jié)果：雞傳染性喉氣管炎病毒和雞新城疫病毒雙重PCR 檢測方法的靈敏度都為10 拷貝/L，對比常規(guī)的PCR檢測方法靈敏度提高100 倍，經(jīng)過多次重復(fù)，檢驗(yàn)結(jié)果均相同。此外，檢驗(yàn)的CT 值和常規(guī)檢驗(yàn)方法對比，其CT 值無明顯差異，均為4%之下。

特異性試驗(yàn)結(jié)果：在反應(yīng)體系內(nèi)單純添加雞新城疫病毒或雞傳染性喉氣管炎的核酸當(dāng)作模板，再后續(xù)添加雞新城疫病毒或雞傳染性喉氣管炎的引物及探針?biāo)M(jìn)行PCR 定量檢驗(yàn)之中，結(jié)果只有對應(yīng)病毒的特異性曲線，試驗(yàn)證明本次研究涉及的引物和探針都具備較強(qiáng)特異性。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果：在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，一共進(jìn)行3 次重復(fù)檢驗(yàn)，所得結(jié)果相同，表明該次研究所建立的PCR 雙重檢驗(yàn)方法具備良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性

樣品試驗(yàn)結(jié)果：使用所建立的雙重PCR 檢測方法對150 份疑似雞新城疫、雞傳染性喉氣管炎的雞病料進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果得出98 份分陽性病料，對98 份均給予測序炎癥以確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，經(jīng)序列檢測及對比，病料與雞新城疫病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒同源性達(dá)100%。

4 討論

在現(xiàn)階段我國雞養(yǎng)殖行業(yè)中，雞疫情一直都是難以解決的問題，而且疫情逐漸趨于復(fù)雜，在很多地區(qū)雞新城疫與雞傳染性喉氣管炎發(fā)病有高度的相似性，這兩種呼吸道疾病對雞的健康有嚴(yán)重危害，而其高度相似性對進(jìn)行診斷及治療有巨大影響，因此，必須要通過專業(yè)試驗(yàn)方法進(jìn)行診斷才能保證治療有效。而傳統(tǒng)的試驗(yàn)檢測方法一般都較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對診斷結(jié)果不夠準(zhǔn)確，敏感性較差，因此，本次研究主要通過建立傳染性喉氣管炎病毒（AILT）和雞新城疫病毒(ND) 雙重檢測方法，旨在促進(jìn)加強(qiáng)我國雞疫情檢測效率。本次研究建立的雙重PCR 檢驗(yàn)方法，雞傳染性喉氣管炎病毒和雞新城疫病毒雙重PCR 檢測方法的靈敏度都為10 拷貝/L，對比常規(guī)的PCR 檢測方法靈敏度提高100 倍，經(jīng)過多次重復(fù)，檢驗(yàn)結(jié)果均相同。此外，檢驗(yàn)的CT 值和常規(guī)檢驗(yàn)方法對比，其CT 值無明顯差異，均為4%之下。特異性試驗(yàn)結(jié)果：在反應(yīng)體系內(nèi)單純添加雞新城疫病毒或雞傳染性喉氣管炎的核酸作為模板，再后續(xù)同時(shí)添加雞新城疫病毒或雞傳染性喉氣管炎的引物及探針?biāo)M(jìn)行的PCR 定量檢驗(yàn)中，所得結(jié)果顯示，只有對應(yīng)病毒的特異性曲線，試驗(yàn)結(jié)果證明，所涉及的引物和探針都具備較強(qiáng)的特異性。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，一共進(jìn)行3 次重復(fù)檢驗(yàn)，所得結(jié)果相同，表明該次建立的PCR 雙重檢驗(yàn)方法具備良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性。樣品試驗(yàn)結(jié)果：使用本次研究所建立的雙重PCR 檢測方法對150 份疑似雞新城疫、雞傳染性喉氣管炎的雞病料進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果得出98 份陽性病料，對98 份均給予測序炎癥以確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，經(jīng)過序列檢測及對比，病料與雞新城疫病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒同源性達(dá)100%。從試驗(yàn)結(jié)果可以得出，本次建立的雞傳染性喉氣管炎病毒和雞新城疫病毒雙重PCR 檢測方法具備良好的敏感度、特異性及準(zhǔn)確性，是一種高速、快捷的檢測方法。