三葉青應用及快速繁殖技術研究進展

李靈，周芳美*

（浙江中醫藥大學醫學技術學院，浙江 杭州 310053）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg），又名石猴子、三葉扁藤、絲線吊金鐘等，葡萄科崖爬藤屬多年生常綠草質蔓生藤本植物。其作為我國特有的珍稀中藥品種，是新“浙八味”之一，具有消炎止痛、清熱解毒、活血散結、祛風化痰的功效[1]。此外，三葉青具有較高的園藝價值，可做室內盆景，極具觀賞性。近年來由于三葉青抗病毒、抗腫瘤等功效的發掘[2]，市場需求量不斷增加，價格逐年攀升。過度采挖和馴化不足加劇三葉青野生資源的匱乏。繁殖體系優化和資源開發成為三葉青應用過程中的重要課題。本文就三葉青的種質資源、臨床應用、繁殖方式、栽培技術等方面的研究進展作如下綜合論述。

1 種質資源

三葉青為我國南方的特有物種，根據藤形態顏色、葉片邊緣鋸齒分為紫藤和青藤兩個品種，兩者生長特性、繁殖方式大致相同，生長地域分明，不混合生長[3]。紫藤三葉青主要分布于37°18’以北的浙江、江西等地的山區，相比之下青藤品種分布更加廣泛，分布于27°18’以南的福建、湖南、四川、貴州、廣西、云南部分地區[4]。三葉青植物為陰生植物，喜斑駁光照，多生于海拔300～1000m山谷、灌叢、石壁陰濕處等環境中，蔭庇度40%～50%，年均溫度在16～22℃；忌陽光暴曬，忌積水，忌霜凍，喜肥沃疏松富含腐殖質的砂質土[5]。抗病能力強、蟲害少，陰濕環境可鋪地栽植，覆蓋率以及成活率均較高。三葉青為多年生植物，繁殖速度慢，種子產量稀少。農家生產常自繁自用、只種不選，多采用無性扦插繁育，導致三葉青種質逐漸退化。隨著三葉青研究的深入，其更多藥理作用將被挖掘，市場需求量將越來越高，進而加劇供需缺口。屆時，三葉青可能成為珍稀野生藥材原料。尋找一種快速、高效的三葉青繁殖技術是當務之急。

2 生物活性研究

2.1 抗腫瘤作用

三葉青根多糖通過下調細胞中miR-151含量來抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導其凋亡[6]；總黃酮還可以有效抑制HepG2細胞，并呈時間、劑量依賴性地使HepG2細胞凋亡[7]；三葉青的塊根提取物異槲皮苷可以減少HGF誘導的親本或HGF/sf轉染的膀胱癌細胞株NBTII細胞的遷移和侵襲[8]。

2.2 抗病毒作用

三葉青萃取后的乙醇提取物正丁醇和乙酸乙酯有抗呼吸道合胞病毒活性的作用且明顯優于利巴韋林[9]。劉江亭等[10]進行體內藥效試驗后得出三葉青的塊根醇浸物中、大劑量可有效提高患甲型H1N1流感病毒性肺炎模型小鼠的存活率和肺指數抑制率。

2.3 抗氧化作用

孫永等[11]提取三葉青葉片及根部的成分得出其可降低大鼠體內MDA含量，使SOD、T-AOC水平升高，同時使GSH含量升高，從而顯著增強大鼠自身的抗氧化能力。何文等[12]研究表明三葉青的黃酮類和酚類提取物可能是其抗氧化功能的物質基礎。

2.4 抗炎、鎮痛、解熱作用

現代藥理試驗顯示，三葉青富有鎮痛消炎功效，臨床表明其可有效緩解小兒外感高熱，即起到解熱作用[13]。黃有強等[14]得出三葉青多糖可以有效抑制LPS誘導的巨噬細胞凋亡，并使巨噬細胞中炎性因子TNF-α、IL-6含量顯著降低。

2.5 護肝作用

三葉青提取成分還能有效保肝降酶和抗纖維化。三葉青提取物乙酸乙酯可顯著抑制HBsAg和HBeAg的分泌，阻止HBV-DNA的復制，為量效、時效關系。

3 臨床應用

臨床上，三葉青可應用于肝癌、宮頸癌、肺癌、白血病、艾滋病等多種疾病的救治，被譽為安全無毒性的“植物抗生素”。史奎鈞[15]臨床應用“振元抑瘤方”治療惡性淋巴瘤，此方具有扶正固本、清熱化痰、解毒散結、養陰益氣的功效。杜琪威等[16]研究表明三葉青通過降低LC3蛋白表達，抑制乳腺癌細胞保護性自噬，對散結抗癌方聯合新輔助化療具有一定療效。三葉青提取物對宮頸癌Hela細胞增殖起有效抑制作用，可通過上調P53及Bax蛋白表達誘導Hela細胞凋亡，下調MMP-2、MMP-9影響Hela細胞遷移、侵襲[17]。

4 現代繁殖技術

目前野生三葉青資源流失匱乏，屬于瀕危珍稀藥用植物[18]，馴化程度不高，嚴重影響了三葉青產業的發展，因此優化繁殖技術以及發展新品種選育刻不容緩。近年來三葉青繁殖體系得到快速發展，如組培快繁、誘導轉基因等多種現代繁殖途徑，為保護三葉青資源提供了技術支持。

4.1 扦插繁殖

扦插為三葉青最普遍的繁育技術，其操作簡易、管理方便。扦插基質、插穗類型、生長調節劑種類等均對三葉青的繁育有顯著影響。趙富群等[19]創制在水溶液中扦插培育三葉青的方式，與組培相比極大降低了成本，便于管理，與傳統扦插相比不受季節影響，且添加植物生長素IAA可以達到快速生根目的；洪霞等[20]利用立體限根栽培模式對三葉青帶芽莖段進行扦插，研究發現采用控根容器進行繁育時，每個容器為2株時總產量較低，當每桶3株時有較高存活率，隨后密度越大，存活率下降，此外該研究認為帶葉片的莖段可進行蒸騰，防止插條腐爛，顯著提高存活率。

4.2 組培快繁

組織培養又叫離體培養，目前該技術快速發展，不斷得到優化完善。植物激素的選擇對三葉青的組培發育起到極為關鍵的影響。洪春桃等[21]針對三葉青的腋芽誘導以及不定芽誘導體系進行優化，得出滅菌的腋芽莖段為最佳外植體，25%活性炭+0.5 mg/L 6-BA+1/2MS為最適腋芽誘導培養基，MS+0.2mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA為最適不定芽誘導培養基。史清英等[22]將印度梨形孢接種至三葉青組培幼苗根部，有效促進了三葉青前期的生長發育、營養吸收以及抗逆性。

不少研究也提及三葉青組織培育過程中外植體的選擇和處理。羅常榮等[23]針對組培外植體的消毒方法進行研究得：以三葉青莖段腋芽為外植體，75%乙醇浸泡5 min，0.1%氯化汞震蕩10 min為最適消毒方法。王靜[24]等研究表明帶腋芽3～8節的半木質化莖段作為外植體效果好于帶芽莖尖。目前還有利用液體懸浮培養、誘導出三葉青愈傷組織的方法，向倩倩等[25]利用發根農桿菌株系C58C1成功誘導出三葉青毛狀根，且生長狀態良好。

5 栽培技術

5.1 栽培模式

三葉青栽培模式主要包括仿野生林下栽培、大棚栽培以及大田栽培。倪川等[26]研究發現大棚栽培的三葉青光合能力和生長情優于林下栽培的三葉青，郁閉度60%～70%的闊葉林下用控根容器栽培的三葉青光合性能和葉片形態最佳。

5.2 栽培基質

三葉青宜種植在土質肥沃疏松、排水性能好的微酸性背陽林地。林秀明等[27]進行林下仿生栽培技術時得出栽培基質中蛭石、黃土、珍珠巖、有機肥和泥炭以2∶2∶1∶3∶2的配比種植三葉青效果最佳。

5.3 田間管理

三葉青管理較粗放，除草時應避免傷及根系。夏季溫度過高可通過霧狀噴灌，低溫可用稻草、樹枝覆蓋保暖防寒。可適當施草木灰，促進腋芽生長。三葉青病蟲害較少，霉菌病可噴施硫菌靈。

6 展望

三葉青含有黃酮、多糖等多種有效活性成分，全株和全草可入藥，集抗腫瘤、抗病毒、解熱化瘀、消炎鎮靜、護肝等眾多療效于一體，兼具安全無毒性的特點，為最理想的廣譜“植物抗生素”，同時可作為觀賞性盆景，具有極高的經濟價值、社會價值和生態效益。由于三葉青的生存條件要求嚴苛，喜陰濕、喜散射光，加上生長緩慢和人為毀滅性挖掘，近年來三葉青數量銳減，遠不能滿足三葉青產業發展和市場需求量。因此有必要優化現代三葉青快速繁殖技術和先進栽培技術，這對于三葉青資源的保護和可持續發展具有十分重要的現實意義。

目前國內外對于三葉青快速繁殖技術研究仍較少，研究者多采用傳統的扦插技術培育三葉青。此外，人們缺乏對三葉青種植資源現狀的深入探索。因此有必要廣泛收集三葉青的種植資源，不斷改進、優化三葉青快速繁殖體系，從而有效改善三葉青種植資源緊缺、馴化不足的現狀。組培技術是進行三葉青快速繁殖的有效途徑，具有較大的發展潛力，有望實現三葉青大批量、規模化生產。此外，轉基因、理化誘變等創新研究成功培育出三葉青優質新品種。相信憑借三葉青藥效的普及應用，加之現代先進繁育技術的輔助，三葉青經濟價值和生態效益必定會得到充分有效的開發利用。