德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物對常見病原菌的抑制作用

陳 華，彭 浩，胡方興，梁 偉，張 鎵，魏 莎，鄔國軍

(1.湖南省長沙市第三醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410015；2.中南大學湘雅三醫(yī)院燒傷整形外科，湖南長沙 410006；3.中南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物學系，湖南長沙 410078)

臨床研究表明，許多常見病原菌(如銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等)的耐藥性正隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用而逐年升高[1-3]。同時，抗菌藥物的大量使用，甚至濫用，導(dǎo)致了多重耐藥菌的產(chǎn)生，從而嚴重地破壞機體微生態(tài)環(huán)境。因此，尋找新的抗菌治療方法一直是抗微生物感染治療研究的重點和熱點。近年來，采用以菌治菌理念的微生態(tài)療法(微生態(tài)移植)治療相關(guān)感染性疾病已取得了一定的成果，但目前的研究主要集中在腸道感染性疾病，特別是難治性或復(fù)發(fā)性艱難梭菌性腸炎的治療上[4]。然而常規(guī)的微生態(tài)移植特別是腸道微生態(tài)移植也有一定的不良反應(yīng)，如可能導(dǎo)致菌血癥等[5-6]，故將益生菌用于以菌治菌將具有更大的應(yīng)用前景。乳酸菌類由于其獨特的生物學特性進入了研究者的視野。已有報道乳酸菌用于感染性疾病的治療，并取得了很好的療效，其治療的原理主要涉及該類細菌能產(chǎn)生具有抗菌作用的細菌素等[7-8]。德氏乳桿菌保加利亞亞種俗稱保加利亞乳桿菌，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品工業(yè)[9]，其發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，可以有效緩解乳糖不耐癥，促進營養(yǎng)成分的利用和吸收，并且能夠改善產(chǎn)品的風味。有研究表明，德氏乳桿菌保加利亞亞種可產(chǎn)生細菌素等非抗菌藥物的殺菌物質(zhì)[10]。實驗室研究發(fā)現(xiàn)，德氏乳桿菌保加利亞亞種對大腸埃希菌具有較強的抑菌和抗黏附作用[11]，對幽門螺桿菌亦具有一定的抑菌活性[12]；而且，目前少有從人類感染性標本中分離出該菌的報道，故該菌可能是抗細菌感染較好的候選細菌。

1 材料與方法

1.1標本來源 德氏乳桿菌保加利亞亞種為中南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物學系保存；大腸埃希菌(6株)、銅綠假單胞菌(5株)、肺炎克雷伯菌(6株)、居泉沙雷菌(4株)、產(chǎn)氣腸桿菌(5株)、鮑曼不動桿菌(7株)、枸櫞酸桿菌(4株)、黏質(zhì)沙雷菌(5株)、嗜麥芽假單胞菌(6株)、金黃色葡萄球菌(8株，其中有3株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌(6株)等均自長沙市第三醫(yī)院檢驗科微生物室分離并保存。

1.2儀器與試劑 相對分子質(zhì)量3×103及10×103超濾離心管為美國Millipore公司產(chǎn)品；截留相對分子質(zhì)量0.5×103透析袋為美國Viskase公司產(chǎn)品；Infinite F50酶標儀為瑞士Tecan公司產(chǎn)品，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；MRS肉湯培養(yǎng)基及MRS瓊脂培養(yǎng)基均為杭州百思生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；乳酸由日本東芝TBA2000FR全自動生化分析儀測定，試劑盒為北京利德曼生化股份有限公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1德氏乳桿菌保加利亞亞種與常見病原菌的共培養(yǎng)試驗

1.3.1.1篩選適合德氏乳桿菌保加利亞亞種與常見病原菌混合培養(yǎng)的培養(yǎng)基 德氏乳桿菌保加利亞亞種的最適培養(yǎng)基為MRS肉湯培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基pH值較低，一般常見病原菌在該培養(yǎng)基中不能很好地生長。常見病原菌的培養(yǎng)基基本為中性或略偏堿性的培養(yǎng)基，在此條件下德氏乳桿菌保加利亞亞種生長不良，為方便對德氏乳桿菌保加利亞亞種和常見病原菌進行共培養(yǎng)以研究前者對后者的抑制作用，本研究首先將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及MRS肉湯培養(yǎng)基按不同比例混合，配制成混合培養(yǎng)基，以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及德氏乳桿菌保加利亞亞種為指示菌，測定這3種細菌在這些培養(yǎng)基中的生長曲線，以確定適合常見病原菌及德氏乳桿菌保加利亞亞種混合培養(yǎng)的最適比混合培養(yǎng)基。具體方法為：將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基后進行普通培養(yǎng)，將德氏乳桿菌保加利亞亞種接種于MRS肉湯培養(yǎng)基后進行厭氧培養(yǎng)，18～24 h后將菌液作100倍稀釋后備用。將MRS肉湯培養(yǎng)基與營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別按照0%∶100%(即營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基)、10%∶90%、20%∶80%、30%∶70%、40%∶60%、50%∶50%、60%∶40%、70%∶30%、80%∶20%、90%∶10%、100%：0%(即MRS肉湯培養(yǎng)基)的比例配制成混合培養(yǎng)基。生長曲線測定在96孔細胞培養(yǎng)板中進行，每孔中加入200 μL混合培養(yǎng)基，然后接種相應(yīng)細菌5 μL，重復(fù)4孔，培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的4、8、12、16、20、24、48 h各取出一塊培養(yǎng)板，微量振蕩器振蕩混勻后在酶標儀中讀取600 nm處的吸光度值，最后以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標作細菌生長曲線圖。

1.3.1.2德氏乳桿菌保加利亞亞種對銅綠假單胞菌的抑制作用 分別培養(yǎng)銅綠假單胞菌及德氏乳桿菌保加利亞亞種，于對數(shù)生長期時收獲細菌細胞并計數(shù)，然后將銅綠假單胞菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的數(shù)量比例混合，編為1～5號，分別接種于1.3.1.1步驟中確定的最適配比混合培養(yǎng)基中，分別在需氧或厭氧培養(yǎng)條件下于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，挑菌液劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板或MRS瓊脂培養(yǎng)基，再分別于需氧或厭氧條件下培養(yǎng)，以探討德氏乳桿菌保加利亞亞種對銅綠假單胞菌的抑制作用及其最適抑制比。

1.3.1.3德氏乳桿菌保加利亞亞種對常見病原菌的抑制作用 將處于對數(shù)生長期的待測菌及德氏乳桿菌保加利亞亞種按1.3.1.2確定的最適抑制比混合，再培養(yǎng)于最適比混合培養(yǎng)基中，分別進行普通培養(yǎng)及厭氧培養(yǎng)；同時將待測菌接種于含最適配比混合培養(yǎng)基中，普通培養(yǎng)。第2天取菌液接種于營養(yǎng)瓊脂平板，于普通有氧條件下培養(yǎng)，研究德氏乳桿菌保加利亞亞種對常見病原菌的抑制作用。

1.3.2德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用 培養(yǎng)目的菌后，將目的菌用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋為1.5×108CFU/mL的菌液，取100 μL菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂培平板表面，然后在平板上放置5個牛津杯，向1號杯中加入德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物混懸液(含德氏乳桿菌保加利亞亞種菌體)，第2號杯中加入德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液，第3號杯中加入調(diào)整pH值至7.2的德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液，第4號杯加入pH值4.0乳酸溶液，第5號杯加入MRS肉湯培養(yǎng)基對照，每杯200 μL，37 ℃培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果。

1.3.3德氏乳桿菌保加利亞亞種24 h及48 h發(fā)酵上清液對常見病原菌抑制作用的比較 以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌及產(chǎn)氣腸桿菌為試驗菌株。培養(yǎng)目的菌，配成1.5×108CFU/mL的菌液后取100 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，然后在平板上放置牛津杯，并向牛津杯中加入德氏乳桿菌保加利亞亞種24 h及48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液，每菌每種發(fā)酵產(chǎn)物重復(fù)4次，每杯200 μL，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后測量抑菌圈直徑，研究德氏乳桿菌保加利亞亞種24 h及48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液對試驗菌株抑制作用的差異。

1.3.4溫度對德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用的影響 將德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物分裝后，分別經(jīng)60 ℃ 2 h、80 ℃ 2 h、100 ℃ 30 min及120 ℃ 30 min處理，然后以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、鮑曼不動桿菌為檢測菌，研究經(jīng)不同溫度處理后的德氏乳標菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物對這些細菌的抑制作用。

1.3.5德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用成分的初步研究

1.3.5.1配制pH值為3.0、4.0、5.0、6.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3.5.2德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物乙醇沉淀物及乙醇沉淀后的上清液的抑菌作用 向8.0 mL德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物中加入無水乙醇使其終濃度達75%，-20 ℃冰箱過夜后12 000 r/min離心10 min，分離上清液并于室溫下放置24 h以使乙醇揮發(fā)，然后再冷凍干燥，干燥物經(jīng)8.0 mL蒸餾水復(fù)溶后備用。沉淀物用75%乙醇洗滌2次后，除盡上清，并敞開管蓋以使乙醇揮發(fā)。待沉淀物中乙醇揮發(fā)完畢，用不同pH值的PBS溶解，并以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、胞曼不動桿菌、枸櫞酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌及黏質(zhì)沙雷菌為指示菌，利用牛津杯藥物敏感試驗方法研究德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇沉淀物及乙醇沉淀后的上清液的抑菌活性。

1.3.5.3德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸濃度測定及該濃度乳酸溶液對銅綠假單胞菌的抑制作用 以酶比色法檢測德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸濃度，然后以0.01 mol/L pH值4.0的PBS配制該濃度的乳酸溶液，用牛津杯法檢測該濃度乳酸溶液對銅綠假單胞菌的抑制作用。

1.3.5.4德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物80%飽和度硫酸銨鹽析物對銅綠假單胞菌的抑制作用 向8.0 mL德氏乳桿菌保加利亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物加入32 mL飽和硫酸銨溶液，充分混勻后置4 ℃冰箱過夜，10 000 r/min離心10 min后，去上清液，沉淀以2 mL 0.01 mol/L pH值4.0 PBS溶解，將溶解物中置于截留相對分子質(zhì)量為0.5×103的透析袋中，用0.01 mol/L pH值4.0 PBS透析72 h，每24 h換透析液一次，最后將透析后的溶液以0.01 mol/L pH值4.0 PBS補足體積至8.0 mL。以銅綠假單胞菌為指示菌用牛津杯實驗檢測德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)80%飽和度硫酸銨鹽析沉淀物對銅綠假單胞菌的抑制作用。

1.3.5.5德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)相對分子質(zhì)量的初步確定 將德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)相對分子質(zhì)量3×103及10×103的超濾離心管過濾后，以銅綠假單胞菌為指示菌，以牛津杯法檢測濾出液及上層液(離心后留在濾膜上的液體)的抑菌活性。另外，將德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物直接置于截留相對分子質(zhì)量為0.5×103的透析袋中，用0.01 mol/L pH值為4.0 PBS透析72 h，每24 h換透析液一次，最后以銅綠假單胞菌為指示菌，利用牛津杯法檢測透析后的發(fā)酵產(chǎn)物對其抑制作用，以研究該發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌活性成分的相對相對分子質(zhì)量大小。

2 結(jié) 果

2.1德氏乳桿菌保加利亞亞種與常見病原菌的共培養(yǎng)試驗

2.1.1確定適合德氏乳桿菌保加利亞亞種與常見病原菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基 研究結(jié)果顯示，德氏乳桿菌保加利亞亞種在MRS肉湯培養(yǎng)基配比低的混合培養(yǎng)基中生長略差，MRS肉湯培養(yǎng)基配比越高，該菌生長越好，在MRS肉湯培養(yǎng)基配比為20%時，該菌生長速度約相當于純MRS肉湯培養(yǎng)基中的一半左右；金黃色葡萄球菌在MRS肉湯培養(yǎng)基不同配比的混合培養(yǎng)基中均能生長，但在MRS肉湯培養(yǎng)基配比高的混合培養(yǎng)基中生長略差；銅綠假單胞菌在MRS肉湯培養(yǎng)基配比為50%及以上的混合培養(yǎng)基中幾乎不能生長，而在MRS肉湯培養(yǎng)基配比為30%及以下的混合培養(yǎng)基中生長與在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的生長速度相差不大。故后續(xù)試驗選用MRS肉湯培養(yǎng)基配比為20%的混合培養(yǎng)基作為德氏乳桿菌保加利亞亞種與臨床常見病原菌共培養(yǎng)的最適比混合培養(yǎng)基。

2.1.2德氏乳桿菌保加利亞亞種對銅綠假單胞菌的抑制作用及最適抑制比的確定 共培養(yǎng)試驗顯示當銅綠假單胞菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種數(shù)量比在1∶3以上時，混合培養(yǎng)基中均分離不出銅綠假單胞菌，但全部混合培養(yǎng)基中均可分離出德氏乳桿菌保加利亞亞種，表明德氏乳桿菌保加利亞亞種3倍于銅綠假單胞菌及以上時對該菌的生長具有顯著抑制作用。

2.1.3德氏乳桿菌保加利亞亞種對常見病原菌的抑制作用 將臨床常見病原菌分別與德氏乳桿菌保加利亞亞種按1∶3的數(shù)量比混合培養(yǎng)于MRS肉湯培養(yǎng)基配比為20%的混合培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，德氏乳桿菌保加利亞亞種比例3倍于目標菌時對這些病原菌均有明顯的抑制作用。

2.2德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用 利用牛津杯法研究德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物混懸液(含德氏乳桿菌保加利亞亞種菌體)及48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液對常見病原菌的抑制作用，結(jié)果顯示，牛津杯中加入調(diào)整pH值至7.2的發(fā)酵產(chǎn)物、pH值為4.0乳酸溶液及MRS肉湯培養(yǎng)基對照的周圍均無抑菌圈出現(xiàn)，而牛津杯中加入德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物混懸液及上清液的周圍有明顯的抑菌圈，其中48 h發(fā)酵產(chǎn)物混懸液對金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、肺炎克雷伯菌的抑制作用強于48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液(P<0.05)，表明德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物對多種常見的革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌均具有較強的抑制作用。見表1。

2.3德氏乳桿菌保加利亞亞種24 h及48 h發(fā)酵上清液對常見病原菌的抑制作用 利用牛津杯抑菌試驗研究德氏乳桿菌保加利亞亞種24 h及48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液對臨床常見病原菌的抑制作用，結(jié)果顯示，48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液對表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌及金黃色葡萄球菌的抑制作用略強于24 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液(P<0.05)，而對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及鮑曼不動桿菌的抑制作用與24 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物混懸液及上清液對常見病原菌的抑制作用

表2 德氏乳桿菌保加利亞亞種24 h及48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液對常見病原菌的抑制作用

2.4德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的熱穩(wěn)定性測定 結(jié)果顯示，德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分別經(jīng)60 ℃ 2 h、80 ℃ 2 h、100 ℃ 30 min及120 ℃ 30 min處理后，對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌及鮑曼不動桿菌的抑菌活性幾乎無影響，表明德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌成份具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.5德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用成分的初步研究

2.5.1德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇沉淀物及乙醇沉淀后的上清液的抑菌作用 結(jié)果顯示，德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇沉淀物對表中的測試菌均失去了抑菌活性，而乙醇沉淀后的上清液對測試菌仍具備良好的抑菌作用，但抑菌活性均略低于德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物(P<0.05)。表明德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)不能被75%乙醇沉淀，但發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)可能會被75%乙醇部分滅活。見表3。

表3 德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物及乙醇沉淀上清液的抑菌活性

2.5.2德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸對銅綠假單胞菌的抑制作用 利用乳酸測定試劑盒對德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸濃度進行測定，結(jié)果該發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸濃度為20 mmol/L。配制20 mmol/L乳酸溶液，利用牛津杯法檢測該溶液對銅綠假單胞菌的抑制作用。結(jié)果在加有20 mmol/L乳酸溶液的牛津杯周圍無抑菌圈出現(xiàn)，表明20 mmol/L的乳酸溶液不具備對銅綠假單胞菌的抑制作用。

2.5.3德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物80%飽和度硫酸銨鹽析沉淀物對銅綠假單胞菌的抑制作用 將德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)80%飽和度硫酸銨鹽析，鹽析沉淀物以0.01 mol/L pH值為4.0 PBS溶解并對該緩沖液進行透析，以牛津杯法檢測鹽析沉淀物對銅綠假單胞菌的抑制作用，結(jié)果顯示，在加有該菌48 h發(fā)酵產(chǎn)物80%飽和度硫酸銨鹽析沉淀物的牛津杯周圍無抑菌圈出現(xiàn)，表明德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物的80%鹽析沉淀物對銅綠假單胞菌無抑制作用。

2.5.4德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)的相對分子質(zhì)量 將德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物上清液經(jīng)相對分子質(zhì)量3×103及10×103的超濾離心管過濾后，以銅綠假單胞菌為指示菌，以牛津杯法研究了濾出液及上層液對指示菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，不管是發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超濾離心管過濾后的上層液、還是濾出液，均顯示明顯的抑菌活性，表明這些抑菌活性物質(zhì)的相對分子質(zhì)量在3×103左右或以下。

將德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物置于截留相對分子質(zhì)量為0.5×103的透析袋中，用0.01 mol/L pH值為4.0 PBS透析72 h后，以銅綠假單胞菌為指示菌，檢測透析后的發(fā)酵產(chǎn)物對其抑制作用。結(jié)果顯示，在加有透析后德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物的牛津杯周圍無抑菌圈出現(xiàn)，表明德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)相對分子質(zhì)量0.5×103透析袋透析后對銅綠假單胞菌的抑菌作用消失。

3 討 論

乳酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭染色陽性細菌的總稱，主要有乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬等43個菌屬，廣泛存在于人和畜禽腸道及多種發(fā)酵食品中[10,13-14]。乳酸菌的抗微生物活性歸因于其在代謝過程中產(chǎn)生多種抗微生物活性物質(zhì)，如乳酸、苯乳酸、乙酸、過氧化氫、二氧化碳、細菌素及其他低相對分子質(zhì)量化合物[15]。由于這些特性，某些乳酸菌如植物乳桿菌已被開發(fā)為抗微生物感染的新型生物制劑并應(yīng)用于臨床上燒傷的治療，顯示出良好的臨床應(yīng)用效果[16]。

本研究對銅綠假單胞菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種進行共培養(yǎng)試驗，結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種數(shù)量比在1∶3以上時，銅綠假單胞菌的生長受到完全抑制，表明共培養(yǎng)時德氏乳桿菌保加利亞亞種對銅綠假單胞菌有較強的抑制作用。同時，本研究對德氏乳桿菌保加利亞亞種與多種常見病原菌進行共培養(yǎng)實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在普通環(huán)境及厭氧環(huán)境下德氏乳桿菌保加利亞亞種對包括金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌等在內(nèi)的多種常見病原菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。該研究結(jié)果與JEBUR[17]探究嗜酸乳桿菌對燒傷感染常見病原菌抑制作用的結(jié)果相近。由于德氏乳桿菌保加利亞亞種與嗜酸乳桿菌同為乳桿菌屬，因此，JEBUR[17]的研究結(jié)果對本研究起到一定輔證作用。而BOYANOVA等[12]初步探究出德氏乳桿菌保加利亞亞種的抗幽門螺桿菌活性，也對本研究結(jié)果起到一定的補充作用。

本研究還對德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果進行探究，通過牛津杯試驗觀察各組抑菌圈直徑大小以評估其抑菌作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，德氏乳桿菌保加利亞亞種的發(fā)酵產(chǎn)物具有抑菌活性，且發(fā)酵產(chǎn)物中德氏乳桿菌保加利亞亞種的存在對抑菌效果的影響不大，但將48 h發(fā)酵產(chǎn)物的pH值調(diào)到7.2時其抑菌活性基本消失，表明發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)可能只能在酸性環(huán)境中發(fā)揮其抑菌活性。

ARIEF等[18]、RUZ等[19]的研究結(jié)果表明，乳酸菌產(chǎn)生的細菌素能夠抑制金黃色葡萄球菌、淋球菌等，即乳酸菌代謝產(chǎn)物中的細菌素具有明顯的抑菌作用。為了明確德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物抑菌成分，本研究對發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)進行了初步探究。德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸與其抑菌作用無關(guān)；以75%乙醇對德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物進行沉淀后檢測其抑菌活性，結(jié)果表明乙醇沉淀物失去抑菌活性，但乙醇沉淀后的上清液仍具有對病原菌的抑制作用；以80%飽和度硫酸銨對德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物進行鹽析，發(fā)現(xiàn)鹽析沉淀物亦不具備對病原菌的抑制作用，表明該抑制物質(zhì)不能被80%飽和度硫酸銨鹽析沉淀。將德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)相對分子質(zhì)量3×103及10×103的超濾離心管超濾后的濾過液及上層液對銅綠假單胞菌仍具有明顯的抑菌活性；利用截留相對分子質(zhì)量為0.5×103的透析袋對德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物進行透析，透析袋外液體具有對病原菌的抑制作用，透析袋內(nèi)的液體對病原菌無抑菌活性，表明德氏乳桿菌保加利亞亞種48 h發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)相對分子質(zhì)量在0.5×103左右或以下。

隨著抗菌藥物在臨床的廣泛使用，細菌耐藥也變得十分普遍，耐藥菌、多重耐藥菌及泛耐藥菌的感染已成臨床十分棘手的問題。微生物組學研究的廣泛開展，使科研人員意識到可以利用微生物之間的相互作用開發(fā)新的抗感染策略，益生菌特別是乳酸菌由于其獨特的性質(zhì)成為拮抗病原微生物的重要候選菌。本文研究結(jié)果為開發(fā)抗微生物感染的益生菌制劑提供了有力實驗支持。本課題后續(xù)在動物水平研究德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物對燒傷并發(fā)銅綠假單胞菌感染的治療效果研究目前正在進行中，有望為燒傷并發(fā)銅綠假單胞菌感染的治療提供依據(jù)和新思路。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵產(chǎn)物對于臨床常見的多種革蘭陽性、革蘭陰性病原菌均具有較強的抑菌活性，其抑菌機制與該菌產(chǎn)生的耐熱、非乳酸類小分子抑菌物質(zhì)有關(guān)。