那屈肝素鈣聯合rhAPC對膿毒癥患兒TLR3和sE-選擇素的影響

劉紅偉,安冀坤,陳 麗,劉 燕,劉艷靜

(華北石油管理局總醫院：1.兒科；2.皮膚科；3.營養科；4.護理部，河北滄州 062552)

膿毒癥的發生、發展與免疫功能紊亂、異常炎性反應及凝血功能障礙密切關聯，可引起心、肺、腎等器官衰竭甚至膿毒性休克，最終危及生命[1-2]。 特別是兒童患者，由于膿毒癥早期缺乏特異性病癥，易延誤治療，因此在常規抗感染、液體復蘇治療基礎上進行抗凝血治療以改善患兒凝血和免疫功能至關重要[3]。肝素鈣作為常用的抗凝血藥物，可有效改善膿毒癥患兒凝血功能，但是對于患兒的抗炎作用療效并不明確。重組人活化蛋白C(rhAPC)是一種絲氨酸蛋白酶，可通過調控絲氨酸蛋白激酶活化通路、胞外調節蛋白激酶水平等抑制血栓素形成，發揮抗炎作用[4-5]。Toll樣受體3(TLR3)是病原體感染機體后宿主單個核細胞通過免疫結合產生的TLR，其可識別患兒體內病原體，從而通過調控下游信號通路啟動炎性反應，調控基因表達及激活氧化應激反應；而可溶性E選擇素(sE-選擇素)可介導中性粒細胞黏附于內皮細胞，導致患兒血管內皮細胞損傷從而調控炎性反應，二者水平均可作為膿毒癥進展的評價指標[6-7]。因此，本文將以凝血功能及TLR3、sE-選擇素等為評價指標，進一步探討那屈肝素鈣聯合rhAPC治療兒童膿毒癥的療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究對象為2016年6月至2019年12月于本院收治的200例膿毒癥兒童，根據隨機數字表法分為對照組和觀察組A、B、C，每組各50例，年齡3～15歲。4組患兒性別、年齡、小兒危重病例評分(PCIS)等一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。納入標準：(1)符合Sepsis3.0中的關于膿毒癥的診斷標準[8]；(2)中華醫學會兒科學分會制定的PCIS均超過65分。排除標準：(1)存在嚴重心、肝、腎等重要臟器功能障礙者，有血液、免疫、神經系統疾病者；(2)發病前接受免疫抑制劑治療者；(3)對低分子肝素、rhAPC過敏，依從性、耐受性差。患兒入組前均由家屬簽署知情同意書，且該研究已獲得醫院倫理委員會批準。

1.2治療方法 對照組患兒采用常規抗感染治療，并在治療期間適時地補充營養以糾正水電解質紊亂和維持患兒體內酸堿平衡，具體給藥方式如下：靜脈滴注平衡液(晶體/膠體=2/1)，劑量為20～30 mL/kg，速度為99 mL/h。維持患兒中心靜脈壓在8～12 mm Hg，若患兒收縮壓偏低(≤90 mm Hg)，則可添加去甲腎上腺素或者多巴胺，直到收縮壓不低于90 mm Hg，若患兒清除率(Cl)低于41.7 mL/min，則可添加巴酚丁胺。觀察組A患兒在對照組的基礎上靜脈注射rhAPC(廠家：美國Biotic公司；批號：jt-w0738)，2 500 U溶于生理鹽水(每毫升注射液中含有25 mg人血清清蛋白，5 mg 甘氨酸，5.9 mg枸櫞酸鈉)，連續靜脈注射給藥96 h，24 μg/ (kg·h)。觀察組B患兒在對照組基礎上皮下注射那屈肝素鈣(廠家：Sanofi Winthrop Industrie；規格：0.4 mL，4 100 AXaIU；國藥準字J20040118)，每次0.4 mL，12 h 1次，7 d為1個療程。觀察組C在對照組的基礎上聯合使用那屈肝素鈣、rhAPC，給藥方式分別同觀察組A、B。3組患兒均持續治療1個療程，在整個治療過程中醫護人員需密切關注患兒的血壓、體溫、心率等臨床體征。

表1 4組患兒一般資料比較

1.3觀測指標

1.3.1臨床療效 治療7 d后評估臨床療效。(1)體溫穩定在36～38 ℃；(2)心率恢復至正常水平；(3)呼吸頻率小于20次/分；(4)白細胞計數(4～12)×109/L。上述指標至少符合3項則被判斷為有效[9]，治療有效率=有效例數/總例數。統計分析患兒住院時間及治療7 d后的PCIS。

1.3.2血氣指標 治療7 d后測量患動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、血氧飽和度(SaO2)水平。

1.3.3T細胞亞群指標、TLR3及sE-選擇素水平 在治療前和治療7 d后早晨抽取患兒空腹外周靜脈血約3 mL×3份，其中2份用乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝劑處理得抗凝全血，1份以淋巴細胞分離液處理，獲取外周血單核細胞(PBMC)，應用流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)計數外周血T細胞亞群指標(CD3+、CD4+、CD8+)水平，并計算其占淋巴細胞的百分數；另1份使用單個核細胞分離液得到單個核細胞，經固定、破膜及上樣處理后應用流式細胞儀測定TLR3表達水平，熒光染色的TLR3陽性細胞所占總體細胞的百分比即為TLR3的表達陽性率。第3份于4 000 r/min離心10 min(半徑10 cm)，上清液置入EP管中并保存于-70 ℃待檢。應用酶聯免疫吸附試驗檢測EP管中血清sE-選擇素水平，試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3.4凝血功能指標 分別在治療前及治療7 d后采用凝血分析儀(廠家：德國BE股份有限公司；型號：Thrombolyzer XRM型)測定患兒血小板計數(PLT)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、纖維蛋白原(Fib)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、D-二聚體(D-D)水平。

1.3.5不良反應 觀察并記錄患兒治療過程中用藥反應。

2 結 果

2.1臨床療效比較 治療后觀察組C的有效率高于其他3組(P<0.05)，觀察組A、B有效率接近，對照組最低；觀察組C病死率最低，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2血氣指標比較 與治療前相比，治療7 d后4組患兒PaO2、SaO2水平增加，而PaCO2水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中觀察組C治療效果最好，血氣指標優于其他3組(P<0.05)，觀察組A、B療效相近，但優于對照組(P<0.05)。見表3。

2.3自然殺傷細胞(NK細胞)百分率比較 與治療前相比，治療后4組患兒外周血NK細胞亞群各水平均有所改善，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中CD3+、CD4+水平增加，CD8+水平降低，其中觀察組C改善效果最佳(P<0.05)。見表4。

表2 4組患兒臨床療效對比[ n(%)]

2.4凝血功能指標比較 與治療前比較，治療7 d后4組患兒的 PT、PLT、 APTT、TT、 Fib、D-D水平均有改善，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中PLT、Fib水平增加，而PT、APTT、TT、D-D水平降低，且觀察組C改善最佳(P<0.05)。見表5。

2.5TLR3、sE-選擇素水平比較 與治療前比較，治療7 d后4組患兒的TLR3、sE-選擇素水平均降低(P<0.05)，其中觀察組A、B、C治療7 d后各水平低于對照組，以觀察組C降低程度最大(P<0.05)。見表6。

2.6PCIS比較 治療7 d后，4組患兒的PCIS均高于治療前(P<0.05)，觀察組A、B、C的PCIS高于對照組(P<0.05)，觀察組C的PCIS高于觀察組A、B (P<0.05)。見表7。

2.7住院時間比較 治療7 d后，觀察組A、B、C住院時間短于對照組，觀察組C住院時間短于觀察組A、B (P<0.05)。見表8。

2.8不良反應比較 4組患兒治療期間不良反應主要為顏面潮紅、皮疹、血性膀胱炎，不良反應均較輕，且對癥治療后均很快消失，4組患兒不良反應發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表9。

表3 4組患兒治療前后血氣指標比較

表4 4組患兒外周血NK細胞水平比較

表5 4組患兒凝血功能指標比較

組別nFib(g/L)治療前治療7 d后TT(s)治療前治療7 d后D-D(mg/L)治療前治療7 d后觀察組A501.54±0.462.42±0.38abc28.56±4.7617.37±2.501abc1.85 ± 0.410.76± 0.22abc觀察組B501.49±0.512.35±0.43abc27.48±4.4118.76±3.02abc1.81 ± 0.370.98± 0.28abc觀察組C501.42±0.472.72±0.45ac27.83±4.6114.30±2.75ac1.78± 0.341.02± 0.26ac對照組501.46±0.432.05±0.50c26.79±4.3520.24±3.12c1.89 ± 0.311.16± 0.24c

表6 4組患兒TLR3、sE-選擇素水平比較

表7 4組患兒PCIS比較分)

表8 4組患兒住院時間比較

表9 4組患兒不良反應比較

3 討 論

膿毒癥是一種由細菌、病毒等病原體感染而致的全身性炎癥反應綜合征，病原菌入侵后刺激機體產生大量促炎癥介質，進而刺激機體產生大量炎癥因子，導致免疫異常，凝血系統紊亂，最終引起多系統、器官病理學改變，是引起重癥監護病房患兒死亡的重要原因[10]。目前膿毒癥的常規治療在于改善臨床病癥(發熱、營養失調、電解質紊亂等)，并配合抗感染、抗血栓治療等。由于膿毒癥是多種促凝血因子、炎癥介質引起的全身性的炎性反應，常規治療方案療效有限，因此在常規治療基礎上采用強效炎性因子抑制劑可有效改善炎性反應對機體的侵襲，從而調控凝血功能，降低炎性反應對重要臟器的損傷，進而有利于預后。rhAPC作為一種人工合成的蛋白C類似物，其可通過活化內皮細胞蛋白C受體、血栓調節蛋白從而激活磷酸鞘氨醇、PAR-1，發揮抗炎、抗凝血等功效[11]。本研究結果顯示，在常規治療基礎上配合肝素的抗凝治療，以及rhAPC的抗炎治療，能迅速改善患兒臨床癥狀，有效改善患兒血氣指標及PCIS，提高治療有效率，降低病死率，縮短住院時間。整個治療過程中盡管4組患兒均存在一定程度的不良反應(顏面潮紅、皮疹、血性膀胱炎等)，但對癥治療或者停藥后均很快消失，且4組患兒的不良反應發生率無顯著性差異，表明聯合治療安全性可靠，值得臨床推廣應用。

有研究顯示，膿毒癥患兒往往存在免疫系統、凝血系統紊亂，其中免疫系統中CD4+、CD8+等NK細胞表達紊亂，導致機體異常炎性反應，使得血管內皮細胞受損，誘導促凝血因子的高表達，使各凝血指標異常，如，D-D是交聯Fib特異性的降解產物，其水平與病情嚴重程度呈正相關； PLT參與止血和堵塞傷口，其水平升高則會導致生物化學性的黏附聚合，各個物質相互配合，最終誘導血凝狀態的發生[2,12-13]。因此在抗凝治療基礎上聯合使用rhAPC進行抗炎治療，可通過改善炎性反應和凝血功能，從而減少內皮損傷，共同改善患兒臨床癥狀。本研究結果顯示，治療后4組患兒外周血NK細胞亞群水平及凝血功能指標較治療前均有所改善，但均以觀察組C改善效果為優，表明在常規治療基礎上配合使用肝素和rhAPC可有效改善患兒凝血功能和免疫功能，這與沈萍[11]報道一致。

膿毒癥患兒在發生異常炎性反應時，機體會釋放大量的炎癥介質，同時改變機體免疫應答，如激活免疫細胞死亡程序，其中TLR作為機體病原相關分子識別受體，在患兒受到病原菌侵襲時可觸發免疫應答反應，調節患兒免疫功能， TLR3是TLR中可唯一識別病毒雙鏈RNA的受體，其水平變化可有效反映病原體感染機體后的免疫應答情況[14]。 TLR3作為免疫應答反應的上游階段，sE-選擇素則是作為免疫調控結果的中下游階段，其可介導中性粒細胞黏附于內皮細胞，引起內皮細胞損傷，從而使得炎性反應加重，高表達于膿毒癥患兒血清中，因此可作為膿毒癥患兒治療效果的評價指標[15]。本研究結果顯示，治療后4組患兒的TLR3、sE-選擇素水平均降低，觀察組A、B、C低于對照組，而觀察組C降低程度最大(P<0.05)，表明在常規治療基礎上配合使用肝素和rhAPC可有效降低TLR3和血清sE-選擇素水平，從而調控機體免疫功能和改善機體炎癥異常情況，最終有利于患兒預后。分析認為，常規治療可一定程度殺死病原菌，從而降低TLR3受體的表達，進而阻斷下游免疫級聯放大效應，調控NK細胞的表達水平，即CD3+、CD4+水平增加，CD8+水平降低。聯合使用那曲肝素鈣時，抑制Ⅶa、Ⅸa等凝血因子活性，組織型纖維蛋白溶酶原激活劑、組織因子途徑抑制物增多，導致血小板聚集，降低黏附聚集、改善血流動力學狀態、減少內皮細胞損傷等，故而治療后患兒PLT、Fib水平增加，而PT、APTT、TT、D-D水平降低，凝血功能得到改善[5]，而rhAPC則可通過凝血酶-血栓調節蛋白激活蛋白酶激活受體(PAR)-1通路，以及上調1-磷酸鞘氨醇，進一步降低機體炎性反應[11]，使sE-選擇素表達水平降低，減輕內皮細胞損傷，故而形成循環調控體系，調控凝血功能，改善免疫功能和炎性反應，提高治療效果。

4 結 論

那屈肝素鈣聯合rhAPC治療兒童膿毒癥效果顯著，可有效改善凝血功能，調控免疫應答，從而降低血清TLR3、sE-選擇素水平，提高治療效果。