血漿Septin9甲基化在肝癌鑒別診斷中的臨床價值*

沈志明,馮 杰，魏 靜，顏光濤△

(1.贛南醫學院第一附屬醫院檢驗科，江西贛州 341000；2.解放軍總醫院醫學檢驗中心，北京 100853)

原發性肝癌(簡稱肝癌)在我國常見惡性腫瘤中居第4位，在腫瘤致死病因中居第3位，嚴重威脅我國人民的生命和健康[1-2]。我國每年死于肝癌的患者約35萬人，占全世界肝癌死亡人數的50%以上[3]。肝癌的病理類型主要包括肝細胞癌、膽管細胞癌和兼有兩者的混合細胞型肝癌，各型的發病機制、組織學形態、生物學行為、治療方法及預后等方面均有明顯的不同[4]。其中肝細胞癌和膽管細胞癌占比較高，目前肝細胞癌及膽管細胞癌的影像學表現類似，且兩者都表現為肝內占位，因為兩者治療和預后不同，臨床上輔助其他血液檢驗手段充分進行鑒別對其治療方案的選擇至關重要。近年的研究表明,SEPT家族某些成員尤其Septin9與腫瘤的發生直接相關,其功能研究正逐漸成為惡性腫瘤發生機制研究的新熱點[5]。但在肝癌中報道的比較少。本文通過探究血漿Septin9甲基化和其他指標聯合檢測在肝癌篩查中的臨床意義，為肝癌的篩查和鑒別診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選取2018年11月至2019年11月在解放軍總醫院確診且臨床病理資料完整的肝細胞癌患者175例和膽管細胞癌患者101例分別納入肝細胞癌組、膽管細胞癌組，并選取該院同期體檢健康人員163例為健康對照組。175例肝細胞癌組患者中男144例，女31例；101例膽管細胞癌組患者中男58例，女43例；163例健康對照組中男108例，女55例。3組之間年齡差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準 ：(1)首次發現并在解放軍總醫院住院治療，沒有接受任何放化療 ；(2)住院期間通過肝穿刺檢查并取活體組織行病理診斷，依據《美國癌癥分期聯合會(AJCC)癌癥分期手冊(第7版)》明確肝細胞癌和膽管細胞癌診斷；(3)住院后測定血清總膽紅素 (TBIL)、直接膽紅素 (DBIL)、丙氨酸氨基轉移酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶 (AST)、堿性磷酸酶 (ALP)、谷氨酰轉移酶(GGT)、血清總蛋白(TP)、血清清蛋白(ALB)水平及腫瘤標志物甲胎蛋白(AFP)、糖類抗原153(CA153)、糖類抗原199(CA199)、糖類抗原125(CA125)和血漿Septin9甲基化。排除標準：(1)有免疫系統疾病史者；(2)急性或慢性炎癥感染者；(3)合并其他原發性腫瘤患者；(4)其他腫瘤轉移性肝癌患者。本研究通過了解放軍總醫院倫理委員會審查。

1.2方法 所有患者都于住院后治療前采靜脈血送檢，通過臨床電子病歷系統收集患者性別、年齡等一般資料和檢驗相關指標，肝功能項目在羅氏C701分析儀上檢測，其中ALP、GGT、ALT、AST、TP、ALB 使用原裝試劑，TBIL、DBIL 使用和光純耀試劑。腫瘤標志物項目在羅氏e601分析儀上采用原裝試劑檢測。血漿Septin9甲基化采用實時熒光定量PCR法進行檢測，具體操作參考試劑盒說明書。測試標本內參基因β-actin的Ct值≤32.1時為判定有效，試劑盒提供了陽性和陰性對照。

2 結 果

2.1各組間血漿Septin9甲基化陽性表達率比較 肝細胞癌組Septin9甲基化陽性表達108例，陰性表達67例，陽性表達率為61.7%；膽管細胞癌組Septin9甲基化陽性表達40例，陰性表達61例，陽性表達率為39.6%；健康對照組陽性表達率為0.0%，兩兩組間陽性率比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組間血漿Septin9甲基化陽性表達率

2.23組間肝功能和腫瘤標志物檢測指標比較 除年齡外，3組間男女發病比例、肝功能、腫瘤標志物比較差異均有統計學意義(P<0.01)。膽管細胞癌組ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT、CA199、CA125、CA153水平高于肝細胞癌組和健康對照組(P<0.01)，其ALB水平低于肝細胞癌組和健康對照組(P<0.01)，TP、AFP水平則低于肝細胞癌組(P<0.05)。肝細胞癌組ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT、AFP、CA199、CA125水平高于健康對照組(P<0.01)，其ALB水平則低于健康對照組(P<0.01)。見表2。

表2 3組一般資料、肝功能、腫瘤標志物檢測指標比較

2.3肝癌危險因素的Logistic回歸分析 通過SPSS21.0 統計軟件對納入的肝功能指標、血漿Septin9甲基化水平及腫瘤標志物進行二分類Logistic回歸分析，采用Backward：LR方式進行指標篩選，發現GGT和血漿Septin9甲基化檢測在回歸模型中有統計學意義(P<0.01)，通過GGT和血漿Septin9甲基化檢測建立二分類Logistic回歸模型，此模型對肝細胞癌和膽管細胞癌的鑒別診斷準確率為78.3%。見表3。

表3 基于GGT和血漿Septin9甲基化檢測建立二分類Logistic回歸模型

2.4GGT和血漿Septin9甲基化檢測對肝癌的鑒別診斷價值 GGT和Septin9甲基化聯合鑒別診斷肝細胞癌的AUC為0.845(95%CI：0.797～0.893)，明顯優于GGT的0.779(95%CI：0.718～0.841)和Septin9甲基化的0.611(95%CI：0.541～0.680)(均P<0.05)，見圖1。兩指標聯合檢測取約登指數最大時靈敏度為88.6%，特異度為68.3%，優于GGT、Septin9單獨檢測時的靈敏度(84.0%、61.7%)、特異度(67.3%、60.4%)。

圖1 基于GGT、Septin9及其組合的ROC曲線

3 討 論

Septin9基因位于17q25.3，主要編碼Septin9甲基化，其主要生物學功能參與細胞骨架結構形成及細胞質分裂。Septin9基因的突變導致細胞基因組的不穩定，并容易轉化為腫瘤[6]。有基因芯片檢測分析表明,除了在結直腸癌中高表達,Septin9還在卵巢、中樞神經系統、乳腺、甲狀腺、膀胱和前列腺等來源的實體腫瘤中高表達[7-8]。目前致癌的發病理論“腺瘤→癌變”學說主要是指染色體不穩定、微環境不穩定及胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)島上甲基化這3種致病機制[9-10]。至于導致癌變的原因有可能是其中一種或多種機制組合而成，但可以明確位于CpG島上的基因啟動子約占人類基因啟動子的一半，使其成為癌變的主要原因。它們誘導癌癥共同的途徑都是異?；蚣谆瘜е孪鄳虻漠惓１磉_，主要特定癌癥相關基因(尤其是腫瘤抑制基因)，最后導致正常生理功能紊亂。部分文獻研究已明確表明Septin9基因在結直腸癌發生、發展中起重要作用[11-13]。夏常青等[14]研究表明Septin9甲基化陽性率為73.4%，證實血漿Septin9甲基化在結直腸癌診斷中具有重要價值。本研究中肝細胞癌組Septin9甲基化陽性表達率[61.7%(108/175)]高于膽管細胞癌組[39.6%(40/61)]和健康對照組(0.0%)，差異有統計學意義(P<0.01)。因此，Septin9甲基化在肝癌發生、發展過程中也充當了非常重要的角色，甚至可以推測在肝癌發展過程中，Septin9基因同樣起到了抑癌基因的作用。Septin9甲基化抑制了該基因的正常表達，導致其腫瘤抑制功能喪失，最終致異常肝細胞過度表達，導致肝癌的發生。鑒于Septin9甲基化在肝癌中的高陽性率，可以通過檢測血漿Septin9甲基化水平，用于肝細胞癌早篩和診斷，同時也有助于其與膽管細胞癌的鑒別診斷。相比常規檢測腫瘤的方法，如X線檢查、病理活檢、細胞穿刺等，前者存在輻射，后兩個為有創檢查。檢測Septin9甲基化進行肝癌篩查和早期診斷可以做到早期發現、早期治療，且無創，容易普及，可以動態監測，有望成為肝細胞癌的新腫瘤標志物。

GGT屬于一種質膜結合糖蛋白，廣泛分布于腎臟、肝臟、胰腺、腸等人體內多種組織中，其和TBIL、DBIL和ALP升高可見于梗阻性黃疸、膽汁淤積性肝炎和肝癌等疾病中。健康人血清GGT來源于肝臟，主要存在于肝細胞膜和微粒體上，廣泛分布于肝細胞的毛細膽管一側和整個膽管系統，參與谷胱甘肽的代謝[15]。當肝內合成亢進或膽汁排泄障礙時，特別是酒精性肝病或肝臟膽管腫瘤，血清中GGT升高[16]。本研究發現在肝細胞癌組和膽管細胞癌組中ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT高于健康對照組，同時膽管細胞癌組較肝細胞癌組更高(P<0.01)。由于膽管細胞癌為來源于膽道上皮細胞的惡性腫瘤，可發生于膽道系統的各級膽管，其較肝細胞癌更容易出現膽道梗阻和膽汁排泄障礙，因此，ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT在膽管細胞癌組升高更為明顯。其中GGT升高最為明顯，升高的程度和膽道梗阻程度相關，成為鑒別診斷膽管細胞癌的重要指標。同時腫瘤標志物CA199是一種低聚糖類腫瘤相關的糖類抗原，血清CA199明顯增高可出現在消化系統腫瘤患者中，其水平可為正常均值的535倍[17]，本研究顯示肝細胞癌組CA199、CA125、CA153低于膽管細胞癌組(P<0.01)，而膽管細胞癌組CA199升高最明顯，CA125、CA153次之。

研究表明，AFP是目前臨床應用最廣的早期檢測肝細胞癌的指標[18]。然而單一AFP檢測存在假陽性率較高及部分患者AFP正?；蚱偷燃訇幮匀秉c[19]。因此，積極尋找診斷肝癌的重要指標和特異度強的腫瘤標志物具有重要意義。本研究肝細胞癌組TP、ALB 、AFP高于膽管細胞癌組(P<0.01)，證實AFP在診斷肝細胞癌中確實發揮重要作用，而蛋白相對高說明肝細胞癌營養狀況相比膽管細胞癌更好。本研究中GGT和血漿Septin9甲基化檢測在回歸模型中具有統計學意義(P<0.05)，發現GGT和血漿Septin9甲基化聯合檢測具有更高的價值，聯合檢測的AUC為0.845(95%CI：0.797～0.893)，約登指數最大時的靈敏度為88.6%，特異度為68.3%。該模型對肝細胞癌和膽管細胞癌的鑒別診斷準確率為78.3%，均優于單一指標檢測的診斷價值。因此，GGT和血漿Septin9甲基化兩者聯合檢測可為肝癌的早期鑒別及診斷提供一定的參考依據，可以作為肝癌早期篩查和診斷新的腫瘤標志物。關于血漿Septin9甲基化陽性率與肝癌的研究鮮有報道，本研究納入的研究對象較少，設計存在一定局限性，病理金標準的一致性和各指標組合性能驗證需要進一步深入研究。

4 結 論

血漿Septin9甲基化在肝癌的高陽性率報道甚少，有望能成為肝癌診療和預測的新腫瘤標志物，需引起臨床的重視和關注。肝癌的鑒別診斷對其治療極其重要，血漿Septin9甲基化和GGT聯合檢測可為其臨床鑒別診斷提供方向。