全基因組重測序在大豆育種上的研究進展

趙海紅 ，郭泰，王志新，鄭偉，李燦東，徐杰飛，張振宇，趙星棋，王士強

（1黑龍江省農業科學院佳木斯分院，黑龍江佳木斯 154007；2黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江大慶 163319）

0 引言

大豆是目前全世界種植面積相對比較大的作物之一，大豆作為重要的食品、飼料和工業原料，在人類的生產和生活中發揮著重要的作用。2017 年中國大豆播種面積為819.4萬hm2，較上年增加13.8%，全國大豆平均單產為1817 kg/hm2，較上年增加1.2%[1]，這些大豆主要用于國民食用。然而，據估計，中國國內飼料用糧需求在3.8億～4.0億t，而目前飼料用糧僅為2.7億t，飼料糧缺口較大[2]，可見，中國對大豆的需求急需解決。2017 年中國大豆進口量就約為9553 萬t[3]，而且多年來，中國大豆市場供給高度依賴進口，且進口渠道較為集中，美國作為中國大豆第二大進口國，2018年以來，卻與中國的貿易摩擦不斷升級[4]。振興中國大豆產業勢在必行。因此，必須通過大豆品種改良、機械化生產、規模化種植等多種途徑，持續提高中國大豆單產及品質，為改善中國大豆種植提供技術保障。那么，研究大豆在特定條件下的基因表達模式，對于開發和利用大豆種質資源也就十分必要，全基因組重測序工作對大豆育種及相關分子生物學研究意義重大。

2010年，大豆基因序列的揭示[5]，對于開展大豆靶向性分子育種、聚合育種，高效精準地培育大豆新品種及創制新種質具有極大的促進作用，基因測序為了解大豆基因組的結構和進化提供了寶貴資源[6]，有利于大豆的農藝性狀的分析，利用基因測序研究成果可選育出高抗病、抗多種病害、抗除草劑、高品質、高產量的新品種[7-8]，極大豐富大豆品種類型，大大縮短育種周期的同時，為基于測序技術的大豆分子育種打好堅實基礎，使農民增產增收增效的同時，增強中國大豆生產在國際市場上的地位。

1 基因測序技術的發展

基因測序技術在分子生物學和基礎醫學領域應用廣泛，已經從第一代發展到第四代[9]。

1.1 第一代測序技術

1977年Maxam和Gibert[10]報道了通過化學降解測定DNA序列的方法，由于該方法程序復雜、操作繁瑣，后來逐漸被Sanger 法取代。隨后，在Sanger技術的基礎上，發展起來的熒光自動測序技術是應用最為廣泛的第一代測序技術[9]。該測序技術測序精確，但通量較低，成本高，后來逐漸被二代測序技術取代。

1.2 第二代測序技術

2004 年，隨著Roche 公司首次推出以高通量低成本為主要特點的測序平臺，生物學研究正式進入了以二代測序為核心測序手段的時代[11]。第二代測序技術采用的策略是邊合成邊測序，依照Sanger 測序原理，捕捉末端熒光標記來確定DNA 序列[12]。其最顯著的特征是高通量、低成本、自動化程度高，能在很短的時間內完成上百億個堿基對的測序，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測序，滿足極短時間內對基因組進行高分辨率檢測的要求[13]。

1.3 第三代測序技術

鑒于一代和二代測序存在依賴于模板擴增以及產生的序列較短等缺點，在需要進行組裝，比對以及注釋等生物信息學分析時存在著很大的困難[14]，為了補充和進一步完善測序技術，近幾年研發出第三代的測序方法—單分子測序技術(Single-molecule Sequencing)，主要包括生物科學公司的Heli Scope單分子測序儀[15]、太平洋生物科學公司的單分子實時DNA 測序技術(Single-molecule Real-time，SMRT) 和 Oxford Nanopore 公司的單分子納米孔測序技術(The Singlemolecule Nanopore DNA Sequencing)[16]等。現階段大多數的研究還采用第二代和第三代測序數據的結合使用，這能夠有效的解決由二代測序本身局限所導致的研究難題。

1.4 第四代測序技術

英國牛津納米公司研發的MinION測序儀是基于納米孔單分子測序技術的第四代測序技術，其體積比普通U盤稍大，攜帶十分方便，MinION默認運行時間為48 h，其標準識別速度為一秒鐘識別250 個堿基(250 bps)[17]，運行2 min產生的數據就可以用于相關分析，平均讀長可以達到13～20 kb[18]，通過提高測序深度，MinION測序可以達到98%的準確率[19]。但是生物納米孔使用的脂基質，其機械穩定性較弱，反復洗滌會降低測序芯片的使用壽命[20]。

2 全基因組重測序在大豆育種中的應用

近年來基因組重測序也越來越廣泛地應用于物種進化研究和育種研究領域[21,26-31]。2002 年水稻全基因組計劃率先宣布完成[22]。在隨后幾年里，科學家們先后完成了包括黃瓜[23]、玉米[24]、高粱[25]、大豆[5]等物種的全基因組測序，而后，通過基因組重測序從更多的角度來研究作物育種學，比如發現突變位點[26-27]，揭示進化關系[28]、挖掘功能基因[29-30]、分子輔助選擇育種[31]等，這加快了優質新品種的培育進程。全基因組重測序技術逐漸成為重要的育種手段。

在大豆育種研究中，開發誘變群體、獲得有感興趣的變異表型的突變株之后，傳統的正向遺傳學方法往往是通過構建F2分離群體、重組自交系等方法定位與表型相關的基因，要連續選育多代，工作量大而且周期較長。通過全基因組重測序等反向遺傳學手段，可以快速發現與表型相關的基因位點，加快育種進程。

大豆基因序列的揭示[5]后，2010 年Lam 等[32]對31份大豆包括野生種和栽培種進行全基因組重測序，共獲得205614個SNP位點，并發現在野生大豆中等位基因多態性水平要明顯高于栽培大豆。

2012 年李澤鋒[33]利用二代測序技術，對來自中國江南的一個野生大豆基因組（‘蘭溪1 號’，Lanxi1）進行了深度測序(＞50X)，發現‘蘭溪1號’相對其他北方野生大豆來說，與栽培大豆親緣關系更遠，這有可能暗示出大豆是從中國北方開始馴化的。

2015 年Zhou 等[34]人通過對302株野生大豆、地方品種和馴化品種大豆進行大于11X 深度的高通量測序，發現979萬個SNPs，87.68萬個Indels，還有1614個CNVs和6388個大片段缺失。發現230個受選擇區域和162個拷貝數變異。全基因組關聯分析表明10個受選擇區域和9個馴化性狀相關聯，發現13個被注釋為與油脂、株高等農藝性狀相關的位點。與之前QTL定位結果比較分析發現，230 個受選擇區域中96 個與調控油脂的QTL相關，21個區間內包含脂肪合成關鍵基因。

2016年張彥威[6]等對大豆品種‘齊黃34’進行全基因組重測序，共檢測到1519494個SNP位點，357549個小片段InDel位點，4506個結構變異，為分子標記輔助選擇提供了重要的標記資源。同年，33份栽培品種和68 份野生大豆品種這兩個基因的序列被分析[35]，顯示野生型大豆中大豆孢囊線蟲抗性等位基因缺失，大豆孢囊線蟲抗性基因可能是在大豆馴化過程中人工選育出來的。

2017年周航[36]對細胞分裂素信號轉導具有反向調節作用的GmAP1.2基因在大豆中的功能進行了研究，探討了其與GmARR10 的差別，為大豆抗逆和開花基因的發掘應用以及大豆分子育種提供了理論依據。

2018年葛逢勇[37]通過表型鑒定在大豆孢囊線蟲表現廣譜抗性的PI437654突變群體中，獲得對大豆孢囊線蟲4 號生理小種侵染表型發生變化的序列初步分析，以期后續研究最終鑒定出大豆抗大豆孢囊線蟲4號生理小種基因。同年，張峰閣[38]研究表明，突變體ZK1917 和‘黑農35’在Dt2 和GmSOC1CDS 區未發生變異，通過對Dt1/Dt2/GmSOC1表達量的監控，發現目的基因可能在V2 期生長點通過影響GmSOC1 與Dt1的結合作用，從而釋放Dt1 的表達，進而影響結莢習性。

此外，通過全基因組重測序技術，對大豆矮桿基因[39]、大豆根中磷酸鹽缺乏的響應基因[40]、對黑豆抗胞囊線蟲基因[41]等進行了相關研究，為大豆分子育種提供了理論依據。

3 展望

隨著第三代、第四代測序技術的不斷完善和發展，將來測序成本會大幅度降低，測序的通量和準確性也會不斷提高，高通量測序技術將成為一項常規的實驗方法，通過這一方法，轉基因技術在應用中遇到的一些問題將迎刃而解，比如大豆的許多經濟性狀是數量性狀，受微效多基因控制，而且基因數量龐大，分離目的基因困難；外源DNA 直接導入，一般導入的是總DNA，缺乏標記基因，鑒定難度大；轉化后表達基因的調控、標記基因的去除等，這些目前研究熱點問題將會得到有效地解決。隨著分子生物學的快速發展，全基因組重測序技術必將會在大豆育種中大顯身手。最終人類將會突破了自然資源的限制，按照需要選擇基因，更進一步的改造大豆的遺傳物質，賦予其新的性狀，大幅度提高了大豆的產量和品質，使大豆可能同時具有高產、優質、抗病蟲、抗寒、抗旱、抗除草劑等多重優點。大豆育種已進入了新的時期。