蜜柚發酵酒與蒸餾酒香氣成分的GC-MS分析

江飛鳳，龍運忠，譚曉輝，胡鵬剛*，趙玲燕，婁興維，潘雪梅

（1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.荔波昌輝食業有限公司，貴州 荔波 558400）

荔波蜜柚是當地特色農產品屬于一種蕓香科柑橘類水果，其果實有淡淡的清香味，具有口感酸甜、涼潤等特點[1-2]。蜜柚的營養成分豐富，富含糖類、維生素、礦物質、類黃酮，具有健脾、潤肺、補血、清腸、利便等功效，其果肉中含有類似胰島素成分的鉻和生物活性物質生物苷，具有降低血液黏稠度，減少血栓形成，對腦血栓、腦卒中等腦血管疾病有較好的的預防作用[3-5]。其釀造的蜜柚果酒營養價值高，含有17種氨基酸、維生素和礦物質，具有飲用滋補雙重作用[6-7]。

荔波當地的蜜柚年產量較大，蜜柚被加工成為地方特色系列產品。其釀造的蜜柚果酒以其果香優雅怡人，酒體清亮透明，酒香濃郁，口感純正而受到越來越多的消費者所青睞。據研究表明，香氣是構成果實和果酒質量、典型性的主要因素[8]，也是對酒感官評定的一個直接影響因素[9]，氣-質聯用技術分析酒類香氣成分是當前有效分的析方法。游玉明[10]通過氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析柚子酒經超高壓處理后香氣成分中產生了芳樟醇、乙酸異戊酯等新物質。移蘭麗等[11]通過GC-MS聯用技術分析沙田柚蒸餾酒在橡木桶陳釀過程中有風味增加的變化情況，使其香氣更為濃郁。杜昌陳等[12]通過GC-MS檢測到添加柚果皮能夠增加沙田柚二次蒸餾酒中月桂烯和檸檬烯的含量，改善其蒸餾酒的風味品質。

當前，關于蜜柚發酵酒與其經過陳釀的蒸餾酒香氣成分還鮮有報道。本研究以蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒為研究對象，采用頂空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）、氣-質聯用（GC-MS）技術對其香氣成分進行分析，并應用香氣成分的定量結果與該物質的香氣閾值比得到香氣活性值[13]來評價它們對蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒香氣特性的貢獻程度。為進一步研究荔波蜜柚酒提供數據支撐和研發地方特色蜜柚酒奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜柚：貴州省黔南布依苗族自治州荔波昌輝食業公司；酵母：安琪酵母股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷（分析純）：上海橋杜生物科技有限公司；無水葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；次甲基藍、酚酞（均為分析純）：天津市化學試劑供銷公司。

1.2 儀器與設備

新II型果酒蒸餾機組：河南新鄉中輕機械有限公司；北京科偉永興儀器有限公司；DH5000 II恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；LH-B55數顯糖度計：杭州陸恒生物科技有限公司；YM-060ST超聲波清洗機：深圳市方奧微電子有限公司；HP6890/5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫公司；DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取纖維頭：美國Supelco公司；FB-5MS氣相色譜柱（30m×0.25mm×0.25 μm）：美國J&W Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蜜柚酒的釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

預處理：挑選新鮮蜜柚，清洗去除雜質和異物，去皮去籽破碎得純果肉。

成分調整：預處理好的果肉按照料水比（92∶43）進行混合，稱取15%的白砂糖進行溶糖，根據實際經驗值（16.8 g/L的發酵液經發酵后產1%vol酒精）調節初始發酵液的濃度為240 g/L，以期達到發酵后的蜜柚果酒發酵液酒精度為（14±0.5）%vol。

發酵：發酵液中加入酵母（接種量0.05%）進行28 ℃恒溫發酵，不添加SO2，發酵時間12～14 d，當殘糖含量＜4 g/L時發酵結束。

酒渣分離：發酵液經過壓濾機過濾后再進行后發酵30 d得到蜜柚果酒。

蒸餾：蒸餾溫度90 ℃、蒸餾壓力0.01 MPa、蒸餾速率2.60 kg/min、冷凝水流量4.70 kg/min。餾出液進行去除1%酒頭和去除20%酒尾處理，酒體酒精度為（65±2）%vol，此條件下得到的酒為蜜柚蒸餾酒。

陳釀：地下室自然陳釀28 d根據實際所需進行調配并轉入儲存罐進入陳釀階段（6～9個月）。

滅菌：（85±1）℃保溫15 min滅菌，即得蜜柚發酵酒和蒸餾酒。

1.3.2 蜜柚酒的理化檢測

蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒的理化指標分析測定按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]、GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[15]進行測定；蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒的感官指標分析分別參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[15]和趙瑩[16]的方法來制定執行。

表1 蜜柚發酵酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards for fermented pomelo wine

1.3.3 香氣成分的提取

精密量取酒樣置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中，精密加入混標（甲醇溶解，環己酮1.54 μg，壬酸甲酯0.83 μg）和轉子，水浴60 ℃保溫，同時以250 r/min轉速攪拌，插入裝有已活化的1 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取纖維頭手動進樣器，頂空萃取40 min，移出萃取頭，立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250 ℃）中，熱解吸6 min后進樣，供GC-MS分析[16]。

1.3.4 色譜-質譜聯用儀檢測

色譜條件：FB-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫38 ℃（保留4 min），以3 ℃/min升溫至128 ℃，再以7 ℃/min升溫至268 ℃，運行54 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（99.999%）；柱前壓6.98 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間1 min。質譜條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發射電流34.6μA；倍增器電壓1565V；接口溫度280℃；質量范圍29～500amu[16]。

1.3.5 數據分析方法

定性定量方法：對總離子流色譜圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Wiley275和美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）2014標準質譜圖確定揮發性成分的種類得出定性結果、經內標法進行定量分析，以測定物質的峰面積與待定物質的質量濃度之比等于內標峰面積與內標質量濃度之比計算出各揮發性物質的含量。揮發性成分的香氣活性值（odor activity value，OAV）計算方法參考文獻[13]。

2 結果與分析

2.1 感官鑒定及理化指標結果分析

蜜柚酒的感官鑒定及理化指標分析對于判定酒的品質和風味至關重要，感官評分結果由1名國家專業品酒評審委員和4名從事酒行業的專業工作人員進行品評打分，對5名品評人員的打分求平均值并計算最后得分，滿分100分。蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒感官及理化指標分析結果分別見表2和表3。

表2 蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒感官評分結果Table 2 Sensory evaluation results of fermented wine and distilled liquor of pomelo

從表2可看出，蜜柚蒸餾酒的感官評分總體比蜜柚發酵酒的高，總分為86.8分，蜜柚蒸餾酒酒體澄清透明，具有優雅的果香與酒香、醇和圓潤的口感且具有蜜柚酒獨特的風格。蜜柚發酵酒感官評分欠佳是由于其酒體后味較苦澀，其中蜜柚原料帶來的苦、發酵過程中形成大量高級雜醇類物質帶來的苦都有可能是導致蜜柚發酵酒后味變苦澀的原因，具體復雜化的原因還需要進一步的試驗探索研究。

表3 蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒基本理化指標Table 3 Basic physical and chemical indexes of fermented wine and distilled liquor of pomelo

從表3可看出，蜜柚發酵酒與蜜柚蒸餾酒發酵徹底，總糖含量＜4 g/L。釀造工藝的不同使得各理化指標含量存在較大的差異，蜜柚蒸餾酒中總酸和總酯的含量相對偏低，會使得酒體稍微有點單薄且余味短，可能是試驗操作不當或使用的發酵菌種單一造成。總體來說，蜜柚發酵酒與蜜柚蒸餾酒中的各理化指標均符合國標GB/T 15038—2006和GB/T 10345—2007的限量標準，其果香與酒香突出，香味協調，口感純正，具備蜜柚酒獨特的風格。

2.2 蜜柚發酵酒與蜜柚蒸餾酒的香氣成分分析結果

利用GC-MS分析蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒的風味成分，總離子流色譜圖分別見圖1和圖2。風味物質種類及含量見表4、表5。

圖1 柚子發酵酒香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of fermented pomelo wine analysis by GC-MS

圖2 蜜柚蒸餾酒香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components of distilled pomelo liquor analysis by GC-MS

表4 蜜柚發酵酒與蜜柚蒸餾酒風味物質分類Table 4 Classification of flavor substances in fermented wine and distilled liquor of pomelo

表5 蜜柚發酵酒與蜜柚蒸餾酒風味物質種類及相對含量Table 5 Types and relative contents of flavor substances in fermented wine and distilled liquor of pomelo

由表4和表5可知，蜜柚發酵酒中共檢測出24種香氣成分，其中醇類化合物5種，占柚子發酵酒總香氣成分相對含量的28.19%，酯類化合物12種（31.28%），酸類化合物1種，占香氣成分的比例最大（37.42%），其他類化合物6種（3.11%），醛酮類和烯烴類未檢出。蜜柚蒸餾酒中共檢測出19種香氣成分，2種醇類物質，分別為異戊醇和苯乙醇，異戊醇含量為525.08 mg/L，占蜜柚蒸餾酒總香氣成分相對含量的68.47%，是蜜柚蒸餾酒中相對含量最多的香氣成分，在酒中表現出濃郁的指甲油香氣和威士忌香氣[17-18]，苯乙醇含量為12.54 mg/L（1.63%），具有典型的玫瑰花香氣[19]，其含量是蜜柚發酵酒的1.6倍，可能是蜜柚蒸餾酒在蒸餾的過程中香氣成分得到一定程度的濃縮。酯類化合物7種（25.98%），醛酮類化合物糠醛（3.50%），烯烴類化合物2種（0.15%），其他化合物7種（0.25%），羧酸類物質未檢出。

2.3 蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒香氣成分分析

在蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒中共檢測出4種酯類，2種醇類和3種烷烴類共9種共同香氣成分，主要體現為蕉香、菠蘿香和柑橘香的水果香，玫瑰、薔薇等花香，還伴有酒精、蠟香和奶油香。其中具有奶油香的棕櫚酸乙酯香氣成分相對較大，對酒體香氣貢獻突出，可判斷是蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒主要的呈香物質。

酯類物質是在發酵和蒸餾過程中由醇和酸經過酯化反應生成，主要在發酵過程中產生，是構成花香和果香的主體，在各種酒品的香氣組成中占有重要地位[17，20]。揮發性香氣成分中酯類化合物的數量是較多的一類，蜜柚發酵酒中酯類物質含量為380.99 mg/L，是蜜柚蒸餾酒中酯類化合物相對含量的2倍，分別在蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒中占全部檢出揮發性風味物質含量的31.28%和25.98%，其差距較大的原因可能是在蒸餾和陳釀過程中酯類物質部分揮發或散失導致。各種酯類化合物在酒中的差異也較大，其中丁二酸二乙酯、月桂酸丁酯、棕櫚酸甲酯、9-十六烷酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯和硬脂酸乙酯在發酵酒中出現，蒸餾酒中未檢出。棕櫚酸乙酯，油酸乙酯，亞油酸乙酯等是一類高碳脂肪酸乙酯，其中亞油酸乙酯在人體內可以水解產生人體必需脂肪酸—亞油酸，具有重要的活性功能[19]。蜜柚蒸餾酒中檢測到具有青草香的乳酸乙酯，菠蘿香的辛酸乙酯和乙酸異戊酯在發酵酒中未檢出，其相對含量分別占蜜柚蒸餾酒總香氣成分的21.14%、0.34%和2.09%，其中乙酸異戊酯具有強烈的果香味并帶有梨的酸甜味，是香精香料合成的重要中間體[21]。

醇類化合物主要通過酵母發酵代謝、蛋白質分解等生成[22]。醇類化合物在蜜柚蒸餾酒中的相對含量是較高的，為537.62 mg/L，其相對含量遠大于在蜜柚發酵酒中的含量343.33 mg/L，分別在蜜柚蒸餾酒和蜜柚發酵酒中占全部檢出揮發性風味物質含量的70.11%和28.19%。醇類化合物在各種酒中的差異賦予了酒不同的風味特征，如檢測到2,3-丁二醇的相對含量較高，為252.76 mg/L，占蜜柚發酵酒總揮發性香氣成分含量的20.75%，在發酵酒中呈現濃郁的甜香和奶香，而在蜜柚蒸餾酒中未檢出。兩者相同的醇類香氣組分是異戊醇和苯乙醇，蜜柚蒸餾酒中異戊醇含量（525.08 mg/L）是蜜柚發酵酒（62.04 mg/L）的8.5倍，因此，在蜜柚蒸餾酒中呈現出濃郁的指甲油香、香油香；其次是苯乙醇，蜜柚蒸餾酒中含量為12.54 mg/L（蜜柚發酵酒中為7.80 mg/L），是經磷酸戊糖途徑酵母利用有氧呼吸生成赤蘚糖后形成的，具有清甜的玫瑰花香、薔薇花香。適宜濃度的高級醇能賦予蜜柚酒酒體特殊的香味，使酒體豐滿柔和，圓潤醇厚。

酸類化合物主要來源于脂肪酸代謝途徑或長鏈脂肪酸的降解[23]，是酒中重要的風味物質，對酒體的香氣主要為助香，減少刺激，維持酯類及緩沖平衡的輔助作用[24]。在蜜柚發酵酒中只檢測到了乙酸這一種化合物，這與趙瑩[16]試驗檢測結果一致。其相對含量為455.79 mg/L，占蜜柚發酵酒香氣成分比例較大，在酒中呈現出強烈的酸味，而蒸餾酒中未檢出。高濃度的酸可能是本試驗中新酒比較刺激辣喉，香氣不協調的原因之一。

2.4 蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒香氣活性分析

根據表5中的數據結果，參照各文獻香氣閾值計算各物質的OAV，選擇對蜜柚酒香氣貢獻較明顯及香氣活性值＞1的能被人感知的化合物進行分析，結果見表6。

表6 蜜柚發酵酒與蜜柚蒸餾酒中OAV＞1的主要揮發性風味化合物Table 6 Volatile flavor compounds of OAV＞1 in fermented wine and distilled liquor of pomelo

結果表明，分析鑒定出蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒中共有13種貢獻較大的揮發性香氣成分，其中醇類5種、酯類6種、糠醛和乙酸，是構成蜜柚發酵酒及蜜柚蒸餾酒香氣特性的主要成分類別。這些香氣成分部分來源于蜜柚原料自身，能夠形成蜜柚酒獨特的品種特征性，另一部分來源于發酵陳釀過程中形成的各化合物之間相互協調作用產生的香氣。酒體中香氣活性值越大，則香氣越突出，蜜柚發酵酒中按香氣活度值大小依次排序分別是乙酸、棕櫚酸乙酯、2,3-丁二醇、十四酸乙酯、苯乙醇、葵酸乙酯、反式橙花叔醇、月桂酸乙酯、異戊醇，其中OAV值較大的乙酸可能來源于操作環境控制不當，使得在發酵過程中有醋酸菌等產酸雜菌入侵，導致酒體酸味過烈，口感粗糙。研究表明，酸量少，則酒味淡且余味短，只有適量的酸才能對酒體有緩沖，協調，烘托主體香的作用[35]。OAV值次之的棕櫚酸乙酯（蠟香、果香、奶油香）和2,3-丁二醇具有的甜香、果香，是構成了蜜柚發酵酒酯香的關鍵物質，也是酒體中香氣貢獻較大的呈香物質。蜜柚蒸餾酒中OAV＞100較高的是乙酸異戊酯（OAV=100.1）和糠醛（OAV=220.1），具有濃郁的蕉香、堅果香和餿香[33]是構成蜜柚蒸餾酒香氣貢獻最大的呈香物質，也是本試驗中區別于蜜柚發酵酒所具有的獨特香氣風格。蜜柚蒸餾酒中的異戊醇（OAV=17.5）和苯乙醇（OAV=8.9）對酒體香氣貢獻明顯高于在蜜柚發酵酒中的貢獻程度，在蜜柚蒸餾酒中呈現出濃郁的指甲油香和玫瑰花香，也是構成酒體醇香、醚香、蕉香[36]的特征香氣物質。

此外，蜜柚發酵酒和蜜柚蒸餾酒中相對香氣活性值較小的揮發性物質也是構成其酒體獨特風味的重要部分，各香氣成分之間相互融合，相互抑制的作用能夠使酒體香氣突出，優雅純正，風味更為多元化。

3 結論

本試驗以蜜柚發酵酒與蒸餾酒為研究對象，主要對其揮發性香氣成分經GC-MS技術定性，內標法定量和OAV值進行分析，同時進行感官評分及基本理化指標測定。結果顯示，從蜜柚發酵酒中共檢測到24種香氣成分，主要是醇類、酯類、羧酸類等其他類化合物；從蜜柚蒸餾酒中共檢測到19種香氣成分，主要是醇類、酯類、醛酮類、烯烴類等其他類化合物。蜜柚發酵酒中香氣貢獻較大（OAV＞1）的有9種，其中對酒體香氣貢獻最大的是乙酸，其次是棕櫚酸乙酯和2,3-丁二醇；蜜柚蒸餾酒中香氣貢獻較大（OAV＞1）的有10種，其中對酒體香氣貢獻最大的是糠醛，其次是乙酸異戊酯和異戊醇，這些物質結合其他香氣成分共同賦予了蜜柚蒸餾酒蕉香、指甲油香、堅果香、玫瑰花香等香氣特征。