白首烏酒對癲癇大鼠神經(jīng)元保護(hù)作用及其機(jī)制研究

吳雋松，滕飛翔，楊留才

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江蘇 鹽城 224005）

癲癇是一種慢性腦部疾病，已成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦卒中的第二大常見病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，截至2018年8月全世界患病人數(shù)約為6 500萬人[1]。癲癇以腦部神經(jīng)元過度放電所致突然的、短暫的、反復(fù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征[2]，記憶力下降等認(rèn)知功能障礙是其常見伴隨癥狀，嚴(yán)重危害患者健康并影響生存質(zhì)量。

癲癇的發(fā)病機(jī)制目前有多種學(xué)說[3-4]，其中之一為氨基酸學(xué)說，興奮性氨基酸的釋放和抑制性氨基酸的減少可以通過多種途徑導(dǎo)致癲癇的發(fā)生，如鈣／鈣調(diào)蛋白途徑和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路等。在缺氧、缺血、腦外傷及驚厥等神經(jīng)病理條件下，MAPK迅速被激活，調(diào)控多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)分泌，使多種底物發(fā)生磷酸化反應(yīng)，進(jìn)一步調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮關(guān)鍵性作用[5]。

白首烏（Cynanchum bungei）又名白人參，江蘇省濱?？h出產(chǎn)了國內(nèi)95%的白首烏，當(dāng)?shù)仫嬘冒资诪蹙埔延杏凭玫臍v史，近年來當(dāng)?shù)卣c四川瀘州老窖集團(tuán)攜手打造“百年白首”養(yǎng)生酒更是將白首烏酒的研究推向新的高度[6]。有報道稱，白首烏主要含有二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glycoside，TSG）等生物活性物質(zhì)，并含有多種營養(yǎng)成分及生物活性物質(zhì)，具有抗衰老[7-8]、抗炎[9-11]、抗動脈粥樣硬化[12-13]、護(hù)肝[14]、抗氧化和自由基清除[15-16]等功效。本研究探討白首烏酒對癲癇大鼠神經(jīng)元保護(hù)作用及其機(jī)制，以期為白首烏保健酒的進(jìn)一步開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

雄性Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠），3周齡，體質(zhì)量（40±10）g：中國食品藥品監(jiān)督管理研究院（License no.：SCXK（Beijing）2014-0013）；白首烏酒（52%vol）：瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司；白首烏酒提取物（Cynanchum bungeiliquor extract，CBLE）：500 mL白首烏酒于55 ℃條件下水浴減壓旋蒸2 h至不再有液體蒸出，得240 mL液體白首烏酒提取物。

1.1.2 試劑

氯化鋰、匹羅卡品：美國Sigma公司；硫酸阿托品：漯河市方匯藥業(yè)有限公司；蛋白裂解液、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）總蛋白濃度測定試劑盒：北京盒子生工科技有限公司；鼠抗p38MAPK抗體、鼠抗二抗：美國Cell Signaling Technology公司；蛋白Marker：北京索萊寶科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE電泳液、轉(zhuǎn)膜液：江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；水合氯醛：陜西盤龍翊海醫(yī)藥有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YP2001B電子天平：上海力辰儀器科技有限公司；DYCZ-24N垂直電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Trans-Blot SD轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：上海賽百奧科技有限公司；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)：美國LI-COR生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物的分組

健康雄性SD大鼠50只，置于通風(fēng)條件良好的室內(nèi)。相對濕度控制在（55±5）%，溫度（23±2）℃。常規(guī)飲食，自由攝食攝水，喂食1周以適應(yīng)環(huán)境。采用常規(guī)12 h晝/12 h夜循環(huán)。50只SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白組、模型組、白首烏酒提取物低劑量組（CBLEL，4 mL/kg）、白首烏酒提取物高劑量組（CBLEH，10 mL/kg）。

1.3.2 癲癇動物模型的建立及后續(xù)干預(yù)

SD大鼠經(jīng)腹腔注射氯化鋰（127mg/kg），18～20h后腹腔注射硫酸阿托品注射液（1mg/kg），30min后腹腔注射40mg/kg匹羅卡品，直到出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，每只大鼠匹羅卡品注射劑量≤60 mg/kg?？瞻捉M用生理鹽水代替氯化鋰及匹羅卡品，其他組處理方式同上。觀察大鼠腹腔注射匹羅卡品后行為學(xué)變化。

癲癇性發(fā)作等級評價標(biāo)準(zhǔn)采用Racine評分分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：無任何不良反應(yīng)；Ⅰ級：面部陣攣以及有咀嚼運動；Ⅱ級：以點頭或甩尾為主的肌肉抽搐；Ⅲ級：單側(cè)肢體的陣攣及抽搐；Ⅳ級：雙側(cè)前肢陣攣，伴有站立現(xiàn)象；Ⅴ級：抽搐，持續(xù)站立、身體背曲強(qiáng)直、跌倒。根據(jù)以上評價標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)Ⅳ級以上發(fā)作后進(jìn)入驚厥持續(xù)狀態(tài)認(rèn)為建模成功，為降低大鼠死亡率，在癲癇狀態(tài)后60 min給予地西泮（10 mg/kg）腹腔注射以終止癲癇持續(xù)狀態(tài)，若癲癇仍不停止，可重復(fù)注射地西泮（10 mg/kg）2～3次，直到癲癇持續(xù)狀態(tài)停止[17-18]。

空白組：腹腔注射等體積的生理鹽水，注射完成后觀察大鼠的行為學(xué)變化；CBLEL組：在建模過程中，使用匹羅卡品前30 min腹腔注射4 mL/kg的白首烏酒提取物，注射完成后觀察大鼠的行為學(xué)變化；CBLEH組：在建模過程中，使用匹羅卡品前30 min腹腔注射10 mL/kg的白首烏酒提取物，注射完成后觀察大鼠的行為學(xué)變化。所有大鼠于模型組大鼠癲癇狀態(tài)持續(xù)24 h后處死，取相應(yīng)的器官進(jìn)行后續(xù)實驗。記錄所有組大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，以及24 h內(nèi)癲癇發(fā)作次數(shù)。

1.3.3 大鼠腦組織的處理

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法處理所需腦組織：大鼠腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，用斬頭器取大鼠頭顱，剪開顱骨，取出腦組織浸泡于4%的組織固定液中，送至武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行HE染色以及切片掃描。

蛋白印跡（Western bolt）處理所需腦組織方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，用斬頭器取大鼠頭顱，剪開顱骨，取出腦組織，于冰上快速分離雙側(cè)海馬和鄰近顳葉皮質(zhì)，置于凍存管中，放于-80℃冰箱中備用[18]。

1.3.4 蛋白免疫印跡分析

具體方法參照陳倩等[17]的蛋白印跡試驗方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean±SD），組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行組間方差分析，顯著性差異以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)。Western blot條帶用Image J軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBLE對癲癇大鼠Racine評分、癲癇發(fā)作次數(shù)及首次癲癇發(fā)作持續(xù)時間的影響

癲癇是一種危害人類神經(jīng)系統(tǒng)健康的疾病，癲癇發(fā)作的強(qiáng)度、次數(shù)以及持續(xù)時間等表觀現(xiàn)象可以反映癲癇疾病的輕重程度[19]。由表1可知，與空白組相比，模型組的Racine評分、癲癇發(fā)作次數(shù)和首次癲癇發(fā)作持續(xù)時間較高（P＜0.05）；與模型組相比，CBLE各劑量組分的Racine評分、癲癇發(fā)作次數(shù)和首次癲癇發(fā)作持續(xù)時間減低（P＜0.05）；CBLEH與CBLEL組相比，隨著CBLE劑量的增加，Racine評分、癲癇發(fā)作次數(shù)和首次癲癇發(fā)作持續(xù)時間降低，這說明高劑量的CBLE可以減輕癲癇癥狀。

表1 CBLE對癲癇大鼠Racine評分、癲癇發(fā)作次數(shù)及首次癲癇發(fā)作持續(xù)時間的影響Table 1 Effect of CBLE on Racine score,epilepsia seizure frequency and first epilepsia seizure duration of epileptic rats

2.2 CBLE對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響

腦神經(jīng)的損傷是癲癇發(fā)作給機(jī)體帶來損害的一個重要體現(xiàn)，海馬神經(jīng)元的損傷和脫失在癲癇的發(fā)生過程起到關(guān)鍵性的作用，兩者存在因果關(guān)系[20]?？瞻捉M的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞組織緊密，數(shù)量較多，排列整齊，細(xì)胞核清晰可見（圖1A）；模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞與空白組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞相比較排列松散，有明顯的細(xì)胞缺失，排列不規(guī)整，細(xì)胞核出現(xiàn)萎縮（圖1B）；CBLE各劑量組的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞與模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞相比，組織緊密性有明顯提高，數(shù)量也較多，排列整齊度也有所提高；通過圖1C與圖1D比較可以發(fā)現(xiàn)，高劑量的CBLE可以使癲癇發(fā)作大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)更趨近于正常的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞。

圖1 CBLE對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of CBLE on hippocampal neuron structure in epileptic rats

2.3 CBLE對癲癇大鼠海馬區(qū)p38-MAPK蛋白表達(dá)的影響

p38MAPK蛋白是一種應(yīng)激蛋白激酶，高熱、高滲透壓、脂多糖等刺激可以迅速激活p38MAPK的信號傳導(dǎo)通路[21]。癲癇作為一種對機(jī)體的強(qiáng)烈刺激可導(dǎo)致p38MAPK磷酸化激活，p38MAPK蛋白的表達(dá)量可以反映癲癇的輕重程度。由圖2可知，經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，空白組中p38MAPK蛋白有基礎(chǔ)表達(dá)；模型組中的p38MAPK蛋白表達(dá)量較大，p38MAPK/GADPH比值與空白組的值相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高低劑量的CBLE的p38MAPK/GADPH比值與模型組的值相比都有差異性，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同劑量的CBLE都可以減少p38MAPK蛋白的表達(dá)，CBLE高劑量組中p38MAPK蛋白量更加趨近于空白組，對這說明CBLE可以一定程度的減緩癲癇對機(jī)體造成的強(qiáng)烈刺激。

圖2 CBLE對癲癇大鼠海馬區(qū)p38MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of CBLE on the expression of p38MAPK protein in hippocampus of epileptic rats

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著CBLE劑量的增加，Racine評分、癲癇發(fā)作次數(shù)和首次癲癇發(fā)作持續(xù)時間降低，表明高劑量的CBLE可以減輕癲癇癥狀。高劑量的CBLE干預(yù)可以使癲癇發(fā)作的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)更趨近于正常的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞。這表明CBLE對癲癇大鼠神經(jīng)元具有保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，CBLEH和CBLEL可以減少p38MAPK蛋白的表達(dá)，CBLEH組中p38MAPK蛋白表達(dá)量更加趨近于空白組，表明CBLE干預(yù)后可以一定程度的抑制癲癇對機(jī)體的刺激，抑制p38MAPK蛋白的表達(dá)。

本研究證實了癲癇會對動物大腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞造成損傷，CBLE干預(yù)后可以減輕這種損傷，其機(jī)制可能是通過抑制38MAPK蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)的。這為白首烏酒的進(jìn)一步開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。