高通量測序技術對西藏林芝傳統發酵酸奶及酪乳細菌多樣性研究

馬才仁卓瑪，白瑪普赤，次仁潘多，羅 章，薛 蓓

（1.西藏自治區農牧科學院 農產品開發與食品科學研究所，西藏 拉薩 850032；2.西藏農牧學院 食品科學學院，西藏 林芝 860000）

酪乳和酸奶作為發酵牛奶制品香甜可口，營養豐富，含多種人體必需的蛋白質、脂肪、碳水化合物、氨基酸、維生素、礦物質等。其發酵風味不僅取決于鮮奶的種類和品質，同樣也與發酵過程中的微生物代謝息息相關[1-2]。微生物夠利用鮮奶中的各種營養物質進行發酵活動，進而產生各種不同的風味[3-5]。西藏林芝地區的傳統發酵制品在以肉為主的林芝人日常生活中扮演著不可或缺的角色[6]。但目前為自制酸奶，人盡皆知的是自制酸奶的環境是相對分散和開放的，環境中存在大量微生物，有一些微生物并不能對酸奶的發酵產生有利的影響，環境存在的某些有害微生物反而會導致酸奶的品質下降，影響食用甚至造成危害[7]。酸奶發酵主要用的微生物是乳酸菌，而傳統的乳酸菌檢測方法主要是通過形態觀察、革蘭氏染色和生化反應等進行分析，操作簡單容易得到結果。但無法用于細菌大批量分析鑒定[8-9]。隨著測序技術的不斷發展，高通量測序（highthroughput sequencing，HTS）技術被稱為下一代測序技術，由于成本低、可讀量和質量高，是目前評估微生物多樣性的有力工具[10-11]。該技術越來越受到國內外學者的重視，梁明明等[12]通過研究微生物的遺傳穩定性結合感官評價機制成功篩選出了優質乳酸菌株，楊行等[13]通過基因比對技術分析出新疆喀什地區的酸奶中的優勢菌種為屎腸球菌（Enterococcus faecium），吳均等[14-15]通過對分離出的乳酸菌株進行16S核糖體脫氧核糖核苷酸（16S ribosome deoxyribonucleic acid，16S rDNA）鑒定得出菌株TG1-1為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌，菌株TG1-11為副干酪乳桿菌。

西藏林芝地理位置優越，生物資源豐富，生態地理環境復雜多樣，蘊含著豐富的微生物資源，目前未見高通量測序技術對林芝傳統發酵型酸奶及酪乳相關的研究。為了更好地利用這些微生物資源，本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術，對林芝牧民所食用的傳統酸奶和酪乳中微生物進行分析揭示酸奶中的微生物多樣性，并對細菌群落類型、結構和優勢菌群進行研究和分析，為優化西藏傳統酸奶發酵菌種和工藝提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統發酵酸奶（編號為sn）、酪乳樣品（編號為nl）：購買于西藏林芝市巴宜區覺木溝農牧民家庭（E 94.36°，N 29.64°，海拔2 988 m）。

1.2 儀器與設備

YP3002N電子天平：上海菁海儀器有限公司；TH-86-150-WA超低溫冰箱：北京天地精儀科技有限公司；ZD-F12冷凍干燥機：鄭州比朗儀器有限公司；Eppendorf 5424R高速臺式冷凍離心機：德國Eppendorf 公司；ABI GeneAmp?9700 型PCR儀：美國ABI公司；Illumina Miseq MISEQ測序儀：美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

發酵酸奶及酪乳樣品原料牛乳為犏牛牛乳，分別編號為sn和nl，每個樣品做3個平行。樣品購買后裝入無菌采樣袋中，放入冰盒內，于6 h內帶回西藏農牧學院食品科學與工程實驗室置于-80 ℃冰箱內保藏備用。稱取100 g酸奶及酪乳樣品冷凍干燥后送樣至上海美吉生物有限公司進行后續實驗。

1.3.2 DNA抽提和PCR擴增

脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增參考文獻[16-17]，具體如下：根據細菌基因組DNA提取試劑盒（天根DP302）說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；使用細菌通用引物：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對V3-V4可變區進行PCR擴增，PCR擴增體系為20 μL，4μL5×FastPfu 緩沖液，2 μL2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs），0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu 聚合酶，10 ng DNA模板。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 Illumina Miseq高通量測序

利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.3.4 數據處理

在上海美吉生物醫藥科技有限公司云平臺上進行在線分析（www.i-sanger.com），采用FastTree軟件構建進化樹，使用R語言作圖繪制進化樹。結果可以通過進化樹與reads豐度組合圖的形式呈現。其他數據處理采用SPSS 20.0軟件和Prism 5.0軟件。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計

對原始測序數據、質控后的優化數據及操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）統計見表1。由表1 可知，酪乳（nl）樣品和酸奶（sn）樣品總計測得有效序列條數分別為（58 455±1 145）條和（57 068±1 263）條，共產生（63±2）個和（25±3）個OTU，分別包含7個門、9綱、22目、34科、46屬、61種和7個門、9綱、22目、34科、46屬、61種。

表1 酸奶和酪乳樣品測序數據統計Table 1 Sequence data statistics of yoghurt and buttermilk samples

不同樣本的OTU韋恩圖見圖1。由圖1可知，2個樣本中共同含22個OTU，其中林芝酸奶樣品獨有3個OTU，酪乳樣品獨有41個OTU，分別占各自OTU總數的12%和65%，說明酪乳樣品細菌多樣性較豐富。

圖1 酸奶和酪乳樣品OTU韋恩圖Fig.1 OTU Venn diagram of yoghurt and buttermilk samples

2.2 稀釋曲線

以多樣性指數為表征對實際觀測到的物種數目做稀釋曲線見圖2。由圖2可知，sn和nl樣品的稀釋曲線均基本趨于平緩，說明取樣數量合理，所得序列可基本反映酸奶和酪乳樣品的細菌群落結構。

圖2 酸奶和酪乳樣品稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of yoghurt and buttermilk samples

2.3 樣品Alpha多樣性分析

酸奶和酪乳樣品中的Alpha多樣性指標見表2。由表2可知，nl樣品的Sobs指數、ACE 指數和Chao1指數分別為63.00±4.13、65.80±2.14和64.25±3.13，都比sn樣品中相應的指數值大，說明nl樣品具有較高的微生物群落豐富度。

表2 酸奶和酪乳樣品Alpha多樣性指數統計結果Table 2 Statistics results of alpha diversity indexes of yoghurt and buttermilk samples

2.4 門水平樣本細菌群落結構

酸奶和酪乳樣品門水平細菌群落結構結果見表3。

表3 酸奶和酪乳樣品細菌在門水平群落結構Table 3 Bacterial community structure of yoghurt and buttermilk samples at phylum level

由表3可知，在門水平分布來看，sn和nl樣品中厚壁菌門（Firmicutes）都排在第一位，其相對豐度分別為（99.80±3.47）%和（50.76±2.13）%，厚壁菌門（Firmicutes）為優勢細菌門，這是因為牦牛酸奶中富含大量的乳酸菌，乳酸菌均為厚壁菌門。sn和nl樣品排在第二位的是變形菌門（Proteobacteria），其相對豐度分別為（0.07±0.01）%和（35.53±1.12）%，變形菌門是植物土壤中常有的微生物菌門[18-19]，牧民生活環境惡劣，常常以地為桌，做好的酸奶普遍放在地上，這可能是樣品中均檢測出少量這些微生物的原因[20]。在sn樣品中并未檢測到擬桿菌門（Bacteroidetes），而在nl樣品中其相對豐度為（11.47±0.03）%。

2.5 屬水平樣本細菌群落結構

酸奶和酪乳樣品屬水平細菌群落結構見表4。由表4可知，細菌在屬水平分布來看，乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和醋桿菌屬（Acetobacter）在sn樣品位于前三位，乳桿菌屬相對豐度最高，占據總樣本數量的（74.32±1.23）%，為優勢菌屬。其次為鏈球菌屬（Streptococcus），占據總樣本數量的（25.55±0.45）%，說明鏈球菌屬在牦牛酸奶發酵過程中可能起著較為重要的作用[20]。在nl樣品的屬水平細菌群落結構中相對豐度由高到低的排序為：乳球菌屬（Lactococcus）［（48.44±2.13）%］＞不動桿菌屬（Acinetobacter）［（16.18±1.12）%］＞假單胞菌屬（Pseudomonas）［（15.69±0.89）%］＞金黃桿菌屬（Chryseobacterium）［（11.22±0.56）%］。

表4 酸奶和酪乳樣品細菌在屬水平群落結構Table 4 Bacterial community structure of yoghurt and buttermilk samples at genus level

2.6 屬水平聚類分析

將林芝傳統發酵酪乳（nl）和酸奶（sn）進行屬水平的細菌群落TOP50熱圖分析，結果見圖3。由圖3可知，nl和sn樣品差別較大，共顯示30個細菌屬，排名前十的分別是：乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、醋桿菌屬（Acetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、考克氏菌屬（Kocuria）、明串珠菌屬（Leuconostoc）。根據樣品的熱圖可知，林芝傳統發酵酪乳（nl）和酸奶（sn）樣品在屬水平的群落結構具有較大差異性。

圖3 酸奶和酪乳樣品屬水平物種豐富度熱圖Fig.3 Heatmap of species richness of yoghurt and buttermilk samples at genus level

3 結論

本研究利用Illumina Miseq測序技術對西藏林芝農牧民家經傳統自然發酵的牦牛酸奶及酪乳細菌群落結構進行分析。結果表明，酪乳（nl）樣品和酸奶（sn）樣品總計測得有效序列條數分別為（58 455±1 145）條和（57 068±1 263）條，共產生（63±2）個和（25±3）個OTU，分別包含7門、9綱、22目、34科、46屬、61種和7門、9綱、22目、34科、46屬、61種。通過樣品的Alpha多樣性指數分析表明，雖然與酸奶樣品相比，酪乳樣品具有更高的群落豐富度，但是兩個樣品在門水平上的優勢門均是厚壁菌門（Firmicutes），屬水平上，sn樣品的優勢屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），其相對含量為（74.32±1.23）%，nl樣品中細菌在屬水平上乳球菌屬（Lactococcus）為優勢屬，另外nl樣本中不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）相對含量較高，說明這三屬在牦牛酪乳發酵過程中可能起著較為重要的作用。結果表明，林芝傳統發酵酪乳（nl）和酸奶（sn）樣品在屬水平的群落結構具有較大差異性。