耐酸耐膽鹽益生菌的篩選及其益生特性研究

劉之園，賈俊霞，姜昊蔚，李志蕓，郭 靜，劉志坤，高秀珍

（1.山東理工大學 生命科學學院，山東 淄博 255000；2.山東飛龍食品有限公司，山東 淄博 256102）

益生菌是一類能夠促進腸內菌群生態平衡，對宿主有益的活性微生物[1]。自它被提出以來，益生菌就被廣泛地應用于各個領域[2]。目前研究表明，益生菌具有調節腸道菌群、改善乳糖不耐癥、提高人體免疫力[3]、降低膽固醇[4]、抗癌[5-6]、抗氧化[7]等眾多益生功能。然而，適應胃腸道的低pH環境、高滲透壓的膽鹽環境是益生菌成功定植并發揮益生功能的前提[8]。因此，篩選高耐酸、耐膽鹽的優良益生菌株具有重要的研究意義和應用價值。

近年來，國內外對優良益生菌菌株的篩選及益生菌益生特性的研究比較活躍。張振宇等[3]從11株乳酸菌中篩選出1株在pH3.0的人工胃液中存活率為119.53%且在0.3%的膽鹽中生長率為41.64%的耐酸、耐膽鹽的優良菌株；姚杰玢等[7]從8株乳酸菌中篩選出2株自由基清除能力較強的菌株R36和R39，它們對1,1-二苯基-2-三硝基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、羥自由基（·OH）和超氧陰離子（O2-·）3種自由基的清除能力分別為51.09%、67.86%、72.02%和50.26%、67.67%、72.16%；賀珊珊等[8]從5株益生菌中篩選出1株膽固醇去除率為20.03%、能夠長時間耐受pH為2.5的高酸性環境、膽鹽濃度為0.5%的高膽鹽環境的菌株。但是，目前所篩選到的菌株的優良特性往往僅表現在抗性或者益生特性方面，同時具有抗性和多種優良益生特性的菌株還很少[9-10]。

本研究以13份農用益生菌劑、土法發酵制備的酵素液及表層菌膜樣品為原料，通過初篩及耐酸、耐膽鹽能力的復篩獲得了4株性能優良的益生菌株，并對它們進行了進一步的產酶、自由基清除、產酸等益生特性的研究，旨在為后續益生菌益生功能的研究及應用提供理論基礎及優質的菌種支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農用益生菌劑（市售有機農業安全衛士）：北京餐廚寶生物科技有限公司；酵素液：以生姜、枸杞、大棗、羅漢果、菊花、楊梅、櫻桃、香蕉、柚子、甜瓜等水果的不同組合為材料，采用土法發酵一年以上的酵素液及表層菌膜，樣品均采集自當地民間；氫氧化鈉、濃鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；DPPH、牛膽鹽、豬膽鹽（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（離心柱型）：北京百泰克生物技術有限公司。

乳酸細菌培養基（MRS液體培養基）：牛肉膏10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸鈉5.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，七水硫酸鎂0.05 g，無水硫酸錳0.05 g，吐溫80 1.0 mL，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL。MRS固體培養基：在MRS液體培養基中加入15.0 g瓊脂。葡萄糖單獨滅菌，115 ℃滅菌30 min，其余培養基121 ℃滅菌20 min，滅菌完成后混勻使用。

淀粉培養基：酵母浸粉5.0 g，可溶性淀粉2.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

干酪素培養基：氯化鈉5.0 g，干酪素10.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，干酪素用0.1 mol/L稀堿溶液溶解后單獨滅菌，其他組分一起滅菌，滅菌完成后混勻使用，均為121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LE303E型精密電子天平：深圳市恒科達檢測儀器有限公司；SX-500型全自動高壓滅菌器：日本Tomy Digital Biology公司；MN-KJ型電熱恒溫水浴鍋：海南海森林公波儀器公司；PRG-84465型恒溫培養箱：浙江森林控股有限公司；MNVB-78K型恒溫搖床培養箱：上海智城儀器有限公司；DM750型生物顯微鏡：德國徠卡LEICA公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的初篩與形態學鑒定

將農用益生菌劑、土法發酵制備的酵素液及表層菌膜等共13份樣品進行梯度稀釋，梯度稀釋至10-7，選取適宜的濃度分別涂布于MRS固體培養基上，37 ℃恒溫過夜培養。根據菌落的形態差異挑取不同的單菌落于新的MRS固體培養基上進行恒溫過夜培養。對分離純化獲得的單菌株保藏，并進行革蘭氏染色與鏡檢。

1.3.2 菌株的分子生物學鑒定

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并以其為模板進行16S rDNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。采用細菌通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR產物送至測序公司進行基因測序，利用美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫對測序結果進行BLAST比對，從而確定菌株的種屬。

1.3.3 菌株的耐酸能力

取100 μL活化后的菌液接種至5 mL MRS液體培養基中，37℃靜置培養，直至OD600nm值=1.0，8000 r/min離心10 min棄上清，收集菌體。將菌體懸浮于等體積、pH分別為1.0、1.5、2.0、3.0、4.0的MRS液體培養基中，37 ℃恒溫靜置培養，于0 h和4 h分別取樣，用美藍染色法染色后使用血細胞計數法進行活菌計數，以培養0 h的活菌數為對照，計算存活率公式如下：

式中：A1為在不同pH的MRS液體培養基中培養0 h的活菌數，CFU/mL；A2為在不同pH的MRS液體培養基中培養4 h的活菌數，CFU/mL。

1.3.4 菌株的耐膽鹽能力

取100 μL活化后的菌液接種至5 mL MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養，直至OD600nm值=1.0，8 000 r/min離心10 min棄上清，收集菌體。將菌體懸浮于等體積、膽鹽濃度為0.3%、0.5%、1.0%、1.5%的MRS液體培養基中，37 ℃恒溫靜置培養，于0 h和4 h分別取樣，用美藍染色法染色后使用血細胞計數法進行活菌計數，以培養0 h的活菌數為對照，計算存活率公式如下：

式中：A1為在不同膽鹽濃度的MRS液體培養基中培養0 h的活菌數，CFU/mL；A2為在不同膽鹽濃度的MRS液體培養基中培養4 h的活菌數，CFU/mL。

1.3.5 菌株的產酶能力

取100μL活化后的菌液接種至5mLMRS液體培養基中，37 ℃靜置培養，直至OD600nm值=1.0，8 000 r/min離心10 min收集上清。將牛津杯分別放置在淀粉培養基和干酪素培養基平板上，吸取上清液0.2mL加入牛津杯中，37 ℃培養24 h后觀察牛津杯周圍是否有明顯的酶解圈出現，并測量酶解圈直徑。

1.3.6 菌株的DPPH自由基清除能力

取100 μL活化后的菌液接種至5 mL MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養，直至OD600nm值=1.0。DPPH自由基清除率的測定方法在文獻已報道的方法[11]上做了修改，取1 mL菌液，加入2 mL 0.5 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻后避光反應30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清，于波長517 nm處測定吸光度值。空白組以等體積無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，對照組以等體積無水乙醇代替菌液。

式中：AS為樣品組的吸光度值；A為空白組的吸光度值；A0為對照組的吸光度值。

1.3.7 菌株的產酸能力

取100 μL活化后的菌液接種至5 mL MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h、48 h后分別取樣，8 000 r/min離心10 min收集上清。加入酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定直至出現淺紅色，且30 s內不褪色，分別記錄NaOH的消耗體積，并計算產酸量（以乳酸計）。計算公式如下：

式中：C1為NaOH溶液濃度，mol/L；C2為產酸量，g/L；K為酸換算系數，用乳酸表示，K=0.090；F為測試樣品稀釋倍數；V1為NaOH滴定48 h發酵液消耗的體積，mL；V2為NaOH滴定24 h發酵液消耗的體積，mL；V3為待測發酵液的體積[12]，mL。

1.3.8 數據處理

每個實驗重復三次，采用SPSS 16.0進行數據處理，并用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株的初篩與鑒定

從MRS培養基上挑取形態不同的單菌落于新的固體培養基上，共分離得到形態不同的9株菌株。革蘭氏染色結果顯示，9株菌株均為革蘭氏陽性菌，其形態特征及分子生物學鑒定結果見表1。由表1可知，在9株菌中，菌株B4、B6、B7菌落較小，其余菌落較大；菌株B4、B5、B7、B8表面有突起，其余均無突起；從菌落顏色看，菌株B1、B2、B3、B4為白色，菌株B5、B9為乳白色，菌株B6、B7、B8為淡黃色。將9株菌株的16S rDNA序列提交至NCBI GenBank數據庫進行BLAST比對，初步判定菌株B1、B2、B3為魯梅利桿菌屬蘇旺氏桿菌（Rummeliibacillus suwonensis）、菌株B4和B7為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、菌株B5為芽孢桿菌屬（Bacillus）、菌株B6為副干酪乳桿菌（L.paracasei）、菌株B8為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、菌株B9為植物乳桿菌（L.plantarum）。

表1 9株菌株菌落形態特征及分子生物學鑒定結果Table 1 Colony morphological characteristics and molecular biological identification results of 9 strains

根據文獻報道，魯梅利桿菌屬（Rummeliibacillus）是2009年定義的菌屬，目前關于該菌屬菌株的研究還很少[13]。已報道的研究表明，Rummeliibacillus stabekisii可作為飼料添加劑提高羅非魚的生長和健康狀況[14]；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）被廣泛應用于酸奶、芝士、乳制品的生產中[15]，且具有調節腸道菌群數量[16]、預防腫瘤[17]等益生功能；芽孢桿菌屬（Bacillus）的菌株在新型微生態制劑產品的研發[18]和凈化養殖水體[19]中起到重要作用；副干酪乳桿菌（L.paracasei）廣泛應用于奶酪、泡菜等發酵食品的生產中，能增加干酪產品中游離氨基酸的數量，提高產品質量[20]，還具有抑菌[21-22]、抗腫瘤[23-24]等功能；巴氏醋桿菌（A.pasteurianus）被廣泛應用于醋酸發酵[25]，是多國食醋釀造的主要菌株之一[26]；植物乳桿菌（L.plantarum）被大量應用于發酵產品中，并具有降低膽固醇[27]、降血糖[28]、抗菌消炎[29]、提高人體免疫力[30]等益生功能。鑒于以上菌株潛在的生理功能和應用潛能，后續對它們開展了一系列性質研究。

2.2 菌株的耐酸能力分析

益生菌必須進入人體的胃腸道才能發揮其益生功能，在從口腔到人體腸道的過程中益生菌需要耐受胃部的低pH環境[31]，所以，對酸的耐受是衡量優良益生菌的重要指標。根據食物在胃中的停留時間[32]，把菌株在不同pH下的MRS培養基中培養4 h，隨后進行活菌計數以計算其存活率。9株益生菌在pH為2、3、4條件下的存活率結果見圖1。

圖1 9株菌株在pH 2、3、4條件下的活菌存活率Fig.1 Survival rates of nine strains under pH 2,3 and 4

由圖1可知，除菌株B1、B2以外，其余菌株的存活率均隨著pH的降低而降低。但是，在pH為2、3、4的酸度下孵育4 h后，菌株B1、B2、B3、B4、B6、B7、B9的存活率仍均＞60%，其中菌株B1、B2、B4、B6、B9在pH=2時的存活率＞70%，耐酸能力較強。其中，菌株B1尤為突出，在pH=2時的存活率為100%。綜合看來，菌株B1、B2、B4、B9的耐酸性能較好。為進一步探究耐酸能力較好的菌株B1、B2、B4、B9的耐酸性能，將pH降低到1.0和1.5，再次進行了耐酸實驗，結果見圖2。

由圖2可知，菌株B2和B4在pH=1.0、pH=1.5的酸度下孵育4 h后，仍然表現出了50%以上的存活率。而菌株B1、B9則表現出了更好的耐酸性能，在pH=1.0、pH=1.5的酸度下孵育4 h后，菌株B1的存活率分別為（93.69±2.25）%和（95.57±3.07）%、菌株B9的存活率分別為（87.83±2.00）%和（88.28±0.83）%。目前已報道了大量關于菌株耐酸能力的研究，但這些研究所選取的酸脅迫條件主要集中在pH=2.0及以上，對于菌株在pH=2.0以下的耐酸能力的研究還很少。在已有的報道中，耐酸能力較強的益生菌為韓墨等[30]從內蒙古傳統酸奶中分離出的鼠李糖乳桿菌217-3，該菌在pH=1.5的酸度下孵育4 h后的存活率為72%，仍低于本研究中菌株B1、B9在相同實驗條件下的存活率。因此，綜合來說，菌株B1、B9具有更高的耐酸能力，可以作為具有潛在益生特性的耐酸菌株豐富菌株庫。

圖2 菌株B1、B2、B4及B9在pH 1.0、1.5條件下的活菌存活率Fig.2 Survival rates of strain B1,B2,B4 and B9 under conditions of pH 1.0 and 1.5

2.3 菌株的耐膽鹽能力分析

膽鹽具有抑菌功能，適應人體小腸中的膽鹽脅迫是益生菌發揮益生功能的重要前提[31]，所以，對膽鹽的耐受也是衡量優良益生菌的重要指標。根據食物在胃中的停留時間[32]，把菌株在不同膽鹽濃度的MRS培養基中培養4h，隨后，通過計算菌株的存活率表征它們的耐膽鹽能力。9株益生菌在膽鹽濃度0.3%和0.5%下的耐膽鹽能力測試結果見圖3。

圖3 9株菌株在膽鹽濃度為0.3%、0.5%條件下的活菌存活率Fig.3 Survival rates of nine strains with bile salt concentration of 0.3%and 0.5%

由圖3可知，與膽鹽濃度0.3%相比，在0.5%的膽鹽濃度下菌株的存活率有所下降。在膽鹽濃度為0.5%的條件下孵育4 h后，菌株B2、B6、B8的活菌存活率仍＞65%，分別為（67.59±8.82）%、（68.33±16.07）%、（88.56±0.33）%，表明菌株B2、B6、B8的膽鹽耐受能力相對較好。

為進一步探究耐膽鹽能力較好的菌株B2、B6、B8的耐膽鹽性能，將膽鹽濃度增加至1.0%、1.5%，再次進行了耐膽鹽實驗，結果見圖4。由圖4可知，菌株B2 在膽鹽濃度為1.0%和1.5%的條件下孵育4 h后，仍表現出50%以上的存活率，而菌株B6、B8仍具有65%以上的存活率。其中，在膽鹽濃度為1.0%、1.5%的條件下孵育4 h后，菌株B6和B8的存活率分別為（67.22±7.51）%、（72.22±4.81）%和（82.91±1.91）%、（81.74±1.52）%。因此，菌株B8表現出最強的膽鹽耐受能力。

圖4 菌株B2、B6及B8在膽鹽濃度為1.0%、1.5%條件下的活菌存活率Fig.4 Survival rates of the strain B2,B6 and B8 with bile salt concentration of 1.0% and 1.5%

綜合以上結果，菌株B1、B2、B4和B9的耐酸能力為菌株B1＞B9＞B4＞B2，菌株B2、B6和B8的耐膽鹽能力為B8＞B6＞B2。考慮到菌株B2呈現出相對較好的耐酸及耐膽鹽能力，而菌株B8的耐酸能力遠遠低于其他菌株（圖1），因此，選取菌株B1、B2、B6、B9這4株菌株作為后續益生特性研究的出發菌株。

2.4 益生特性研究

2.4.1 產酶能力分析

產淀粉酶、蛋白酶的益生菌，以一定的活性進入到腸道，無疑可以起到幫助動物消化的作用，因此，以篩選出來的耐酸耐膽鹽能力較好的4株菌株作為出發菌株，測定了其產酶能力，結果見表2。由表2可知，4株菌株均具有產淀粉酶的能力，但是均不能產生蛋白酶。4株菌株的產淀粉酶能力為菌株B6＞B2＞B9＞B1。

表2 4株菌分別在淀粉及干酪素培養基上產生酶解圈直徑大小比較Table 2 Comparison of diameters of enzymatic hydrolysis bands of four strains produced on starch and casein medium

2.4.2 DPPH自由基清除能力分析

DPPH自由基是一種很穩定的自由基，測定益生菌對DPPH自由基的清除率，可以反映益生菌的抗氧化能力[9]。以篩選出來的4株菌株作為出發菌株，測定其DPPH自由基的清除率，結果見圖5。由圖5可知，4株菌株均具有較強的DPPH自由基清除能力，除菌株B2外，菌株B1、B6、B9的DPPH自由基清除率均＞80%。根據文獻報道，現有的乳酸菌DPPH自由基清除率最大值在50%左右[9-11]，姚杰玢等[7]對8株乳酸菌進行DPPH自由基清除特性研究，發現乳酸菌R36的DPPH自由基清除率達（51.09±0.11）%；黃玉軍等[9]對分離自江蘇如皋長壽村人群腸道的6株乳酸菌進行DPPH自由基清除特性研究，發現乳酸菌E2的DPPH自由基清除率達（58.63±0.01）%，均低于本研究中菌株B1、B6、B9的清除率。所以菌株B1、B6、B9在DPPH自由基清除能力方面具有很高的應用與研究價值。

圖5 4株菌株對DPPH自由基清除率的比較Fig.5 Comparison of scavenging rates of DPPH free radicals by four strains

2.4.3 產酸能力分析

產酸能力是菌株活力的重要體現[31]，以篩選出來的4株菌株作為出發菌株，測定其24 h內的總酸（以乳酸計）產量，結果見表3。由表3可知，在4株菌株中，菌株B1、B6、B9在發酵過程中均可產酸，且24 h內菌株B6的產酸能力最強，達13 143.2 mg/L，菌株B2不產酸。其中植物乳桿菌B9的總酸（以乳酸計）產量高于宮路路等[32]篩選出的乳酸產量為4 752.51 mg/L的植物乳桿菌。

表3 4株菌株的產酸量Table 3 Acid production of four strains

綜合4株菌株的產酶、DPPH自由基清除率及產酸能力，認為副干酪乳桿菌B6在這3個方面均優于其他3株菌株，所以副干酪乳桿菌B6是該研究范圍內在益生特性研究方面確定的最佳益生菌株。

3 結論

本研究從13 份農用益生菌劑、土法發酵制備的酵素液及表層菌膜樣品中分離篩選出9株益生菌，并對其耐酸、耐膽鹽能力進行了比較分析。菌株B1對酸性環境的耐受能力最強，在pH為1.0、1.5條件下孵育4 h后的存活率分別為（93.69±2.25）%、（95.57±3.07）%，是目前報道的最高水平；菌株B8對膽鹽環境的耐受能力最強，在膽鹽濃度為1.0%、1.5%的條件下孵育4 h后的存活率分別為（82.91±1.91）%、（81.74±1.52）%。通過耐酸、耐膽鹽能力的綜合分析篩選出了菌株B1、B2、B6、B9四株優良菌株進行進一步的益生特性研究，主要包括：產酶能力、DPPH自由基清除能力及產酸能力。結果顯示，副干酪乳桿菌B6在產酶、DPPH自由基清除及產酸三個方面均優于其他三株菌株，是確定的最佳益生菌株。副干酪乳桿菌B6具有較好的耐酸耐膽鹽能力和優良的益生特性，有良好的應用和研究價值，可作為優良菌株進行下一步的研究與開發。