響應(yīng)面法優(yōu)化富鋅酵母培養(yǎng)條件

黃章嬈，王 昱，崔沛杰，瑪麗娜·庫爾曼，2，包怡紅，2

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

鋅是人體中許多蛋白質(zhì)、金屬酶和催化輔助因子的組成部分[1]，也是影響新陳代謝和生長發(fā)育的重要元素之一[2]。最新研究表明，富含鋅的食物可以改善睡眠質(zhì)量[3]，但缺鋅和鋅攝入過量都會(huì)對(duì)人體健康造成危害[4-5]。酵母菌是一種單細(xì)胞真核微生物，屬于酵母屬，是人類利用最早、最廣泛的純天然營養(yǎng)型微生物[6]，也是天然的營養(yǎng)寶藏和理想的生物載體[7-8]，含有多種人體必需氨基酸、維生素和生理活性物質(zhì)[9-11]，并且具有較強(qiáng)富集微量元素的能力。ZHANG S Q等[12-13]研究表明，硫化鋅、葡萄糖酸鋅和酵母鋅在血漿和組織水平上具有等效的生物利用度，但酵母鋅在體內(nèi)的吸收和保留作用與硫化鋅和葡萄糖酸鋅相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義，而且在提高鋅的吸收率的同時(shí)還可以降低對(duì)腸胃的刺激作用[14-16]。

富鋅酵母是在酵母菌生長的特定條件下加入無機(jī)鋅從而得到富鋅能力強(qiáng)的酵母菌株。作為一種補(bǔ)鋅的安全原料，富鋅酵母有廣泛的應(yīng)用范圍，因此引起各個(gè)領(lǐng)域研究人員的關(guān)注。石玉城等[17]從法國面包酵母中獲得了具有較高產(chǎn)率的富鋅酵母菌株，含鋅量達(dá)4 000～15 000 μg/g；曹源偉等[18]從啤酒酵母中馴化篩選出具有耐鐵鋅能力的富鐵一鋅酵母，該酵母的生物量可達(dá)13.68 mg/mL，鐵元素的轉(zhuǎn)化率可達(dá)71.56%，鋅元素的轉(zhuǎn)化率可達(dá)59.91%；王戰(zhàn)勇等[19]從啤酒酵母中獲得富鋅酵母，其生物量達(dá)到（8.712±1.033）g/L的同時(shí)，鋅含量可達(dá)（7.890±0.802）mg/g；關(guān)轉(zhuǎn)飛等[20]以啤酒廢酵母為原料，制備富鋅酵母，并確定了其最佳工藝條件；YANG C等[21]利用釀酒酵母對(duì)環(huán)境元素進(jìn)行富集，獲得了富鐵鋅酵母，并且研究了pH值、接種量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母富集鐵鋅的影響。但是目前酵母富鋅量不高，紫外誘變、化學(xué)、誘變劑誘變等方法存在輻射性和毒性的局限，因此對(duì)酵母富鋅條件需要進(jìn)一步研究。由此可見，富鋅酵母的馴化，得到較高富鋅量的酵母菌，在微生物學(xué)領(lǐng)域具有重要的學(xué)術(shù)意義，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期從傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的面包坯中篩選得到的性能較好的酵母DLY28為出發(fā)菌株，通過鋅元素馴化獲得一株優(yōu)良耐鋅酵母，并通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其富鋅培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，為微生物方法富集微量元素以及富鋅食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

酵母菌DLY28：由東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

硫酸鋅、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麥芽糖、四硼酸鈉（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、尿素（均為分析純）：天津永大化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏（生化試劑）、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1 000 mg/L鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（1-（2-pyridinylazo）-2-naohthalenol，PAN）（分析純）、胰蛋白胨（生化試劑）：上海源葉生物有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L。YPD固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

H/T20MM臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；DY04-13-44-00立式壓力蒸汽滅菌器筒：上海東亞壓力容器制造有限公司；722型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；FD-IA-80冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器有限公司；VE-10LH-EII綜合型超純水機(jī)：宏森環(huán)保科技有限公司；FA2004型電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌DLY28生長曲線的測(cè)定

在無菌條件下，采用接種環(huán)取酵母菌DLY28于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。按1%（V/V）的接種量將活化的酵母菌液接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。以未接菌的YPD液體培養(yǎng)基為空白，測(cè)定菌液的OD600nm值，前20 h每隔4 h測(cè)定一次，之后每隔2 h測(cè)定一次，直到OD600nm值變化平穩(wěn)為止，以培養(yǎng)時(shí)間（x）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制酵母菌的生長曲線。

1.3.2 固體平板初次馴化酵母菌DLY28[2]

選取16個(gè)酵母菌DLY28單菌落，分別命名為S1～S16，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)15 h，培養(yǎng)菌液按1%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)15 h，稀釋1 000倍后，吸取3 μL滴加于含不同質(zhì)量濃度鋅（0 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L）的YPD固體平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，觀察菌株的生長狀況。

1.3.3 液體培養(yǎng)基二次馴化酵母菌DLY28[2]

從YPD固體平板中，選取耐800 mg/L鋅的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)15 h，按1%（V/V）的接種量接種于含質(zhì)量濃度1000 mg/L鋅的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后取樣，用722型可見分光光度計(jì)在波長600 nm處測(cè)定菌液的OD600nm值。

1.3.3 馴化酵母菌DLY28種子液的制備

將馴化的酵母菌接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h制成種子液。

1.3.4 富鋅酵母培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

碳源種類及質(zhì)量濃度對(duì)酵母鋅吸附能力的影響：以YPD液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖作為碳源，其余組分和質(zhì)量濃度不變，按1%（V/V）的接種量將馴化酵母菌種子液接種于液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，測(cè)定菌液的OD600nm值，篩選出最佳碳源；將最佳碳源質(zhì)量濃度調(diào)整為40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L、140 g/L，添加300 mg/L硫酸鋅，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定生物量（OD600nm值）和鋅吸附量，篩選最佳碳源質(zhì)量濃度。

氮源種類及質(zhì)量濃度對(duì)酵母鋅吸附能力的影響：以蔗糖80 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L的液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以20 g/L的蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素作為氮源，其余成分和質(zhì)量濃度不變，按1%（V/V）的接種量將馴化酵母菌種子液接種于液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，測(cè)定菌液的OD600nm值，篩選出最佳氮源；將最佳氮源質(zhì)量濃度調(diào)整為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L，添加300 mg/L硫酸鋅，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600nm值和鋅吸附量，篩選最佳氮源質(zhì)量濃度。

培養(yǎng)基鋅質(zhì)量濃度對(duì)酵母鋅吸附能力的影響：在蔗糖80 g/L、胰蛋白胨25 g/L、酵母浸粉10 g/L的液體培養(yǎng)基中添加硫酸鋅，使培養(yǎng)基中的鋅質(zhì)量濃度分別為100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L，按1%（V/V）的接種量將馴化酵母菌種子液接種于液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h后，測(cè)定OD600nm值及鋅吸附量。

1.3.5 富鋅酵母DLY28培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

以鋅吸附量（Y）為響應(yīng)值，以蔗糖質(zhì)量濃度（A）、胰蛋白胨質(zhì)量濃度（B）、鋅質(zhì)量濃度（C）為考察因素，進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 富鋅酵母培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for zinc-enriched yeast medium optimization

1.3.6 測(cè)定方法

鋅含量的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[22]的方法測(cè)定鋅含量。

鋅吸附量的計(jì)算公式如下：

鋅吸附量（mg·g-1）=

式中：A1為初始培養(yǎng)基中鋅質(zhì)量濃度，mg/L；A2為富鋅后培養(yǎng)基中剩余的鋅質(zhì)量濃度，mg/L；B為菌體干質(zhì)量，g/L。

菌體干質(zhì)量的測(cè)定：將菌液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，菌體用無菌水清洗三次，將裝有菌體的離心管放入冷凍干燥機(jī)中，-18 ℃預(yù)冷24 h，-50 ℃、6 Pa條件下冷凍干燥24 h后，取出干燥的菌體，采用分析天平測(cè)定菌體干質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌DLY28生長曲線的測(cè)定

酵母菌DLY28的生長曲線見圖1。

圖1 酵母菌DLY28的生長曲線Fig.1 Growth curve of yeast DLY28

由圖1可知，酵母菌生物量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，符合典型的邏輯斯蒂S型生長曲線，0～8 h為遲滯期，8～20 h為對(duì)數(shù)生長期，20 h以后為穩(wěn)定期。處于對(duì)數(shù)生長期的菌體生長旺盛、代謝活性強(qiáng)，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)15 h的酵母進(jìn)行耐高質(zhì)量濃度鋅能力的馴化[23]。

2.2 高質(zhì)量濃度鋅環(huán)境對(duì)酵母菌DLY28的馴化

2.2.1 固體平板初次馴化

16株酵母菌經(jīng)初次馴化后，生長情況見圖2。由圖2可知，隨著鋅質(zhì)量濃度的增高，鋅對(duì)16株酵母菌生長的抑制作用增加，其中酵母菌S6、S7、S8、S10、S11、S12、S15生長較好，說明耐鋅能力較好，因此，選擇這7株酵母菌進(jìn)行二次馴化。

圖2 鋅質(zhì)量濃度對(duì)16株酵母菌生長的影響Fig.2 Effect of zinc concentrations on the growth of 16 yeast strains

2.2.2 液體培養(yǎng)基二次馴化

7株酵母菌經(jīng)二次馴化后，生物量測(cè)定結(jié)果見圖3。

圖3 7株酵母菌二次馴化的生長情況Fig.3 Growth of 7 yeast strains after secondary domestication

由圖3可知，酵母菌S7在鋅質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的YPD液體培養(yǎng)基中生物量最高，由此可知，酵母菌S7的耐鋅能力最強(qiáng)，因此，選擇酵母菌S7進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 富鋅酵母菌S7培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 培養(yǎng)基碳源的篩選

不同碳源對(duì)酵母菌S7生長的影響見圖4。

圖4 不同碳源對(duì)酵母菌S7生長的影響Fig.4 Effect of different carbon source on the growth of yeast S7

由圖4可知，在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中酵母菌S7的生物量最高，OD600nm值達(dá)到1.15，其余生物量由高到低的碳源依次為麥芽糖、葡萄糖、果糖，分析原因可能是由于菌株對(duì)果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝存在障礙，造成碳源利用率低、菌株增殖能力較差[8]，也有可能是酵母基因組中有蔗糖水解酶基因，具有利用蔗糖作為碳源的能力[24]。石玉城等[17]研究發(fā)現(xiàn)，富鋅酵母的最佳碳源為蔗糖，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相似。因此，選擇蔗糖作為培養(yǎng)基的最佳碳源。進(jìn)一步考察蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)酵母菌S7生長及鋅吸附量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)酵母菌S7生長及鋅吸附量的影響Fig.5 Effect of sugar concentration on the growth and zinc adsorption of yeast S7

由圖5可知，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度＜80 g/L之前，酵母菌S7的鋅吸附量和生物量均隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加而增加；當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí)，兩者同時(shí)達(dá)到最大值，分別為11.35 mg/g、1.319；當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度＞80 g/L之后，酵母菌S7的鋅吸附量及生物量隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加而減少，分析原因可能是碳源質(zhì)量濃度過高，酵母菌S7新陳代謝速度增加，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的不斷積累，導(dǎo)致酵母菌的繁殖受到影響[25]。所以，確定蔗糖最佳質(zhì)量濃度為80 g/L。

2.3.2 培養(yǎng)基氮源的篩選

不同氮源對(duì)酵母菌S7生長的影響見圖6。

圖6 不同氮源對(duì)酵母菌S7生長的影響Fig.6 Effect of different nitrogen source on the growth of yeast S7

由圖6可知，在以胰蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中酵母菌S7的生物量最高，OD600nm值達(dá)到1.365，其余生物量由高到低的氮源依次為蛋白胨、牛肉膏、尿素。胰蛋白胨，又稱胰酪蛋白胨、胰酶消化酪蛋白胨，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白胨，具有更豐富的營養(yǎng)，氮以氨基酸和肽類等小分子形式存在，更利于菌體吸收利用[26]。因此，選擇胰蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源。進(jìn)一步考察胰蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)酵母菌S7生長及鋅吸附量的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 胰蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)酵母菌S7生長及鋅吸附量的影響Fig.7 Effect of tryptone concentration on the growth and zinc adsorption of yeast S7

由圖7可知，當(dāng)胰蛋白胨質(zhì)量濃度＜25 g/L之前，酵母菌S7的鋅吸附量和生物量均隨胰蛋白胨質(zhì)量濃度的增加而增加；當(dāng)胰蛋白胨質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)，兩者同時(shí)達(dá)到最大值，分別為12.03 mg/g、1.406；當(dāng)胰蛋白胨質(zhì)量濃度＞25 g/L之后，酵母菌S7的鋅吸附量及生物量均隨著胰蛋白胨質(zhì)量濃度的增加而減少，這是由于過高的底物濃度，會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生高的滲透壓力，影響酵母的生長與代謝，甚至完全抑制酵母的生長[27]。所以，確定最佳胰蛋白胨質(zhì)量濃度為25 g/L。

2.3.3 培養(yǎng)基鋅質(zhì)量濃度對(duì)酵母鋅吸附能力的影響

鋅質(zhì)量濃度對(duì)酵母菌S7生長及鋅吸附量的影響見圖8。

圖8 鋅質(zhì)量濃度對(duì)酵母菌S7生長及鋅吸附量的影響Fig.8 Effect of zinc concentrations on the growth and zinc adsorption of yeast S7

由圖8可知，當(dāng)鋅質(zhì)量濃度＜400 mg/L之前，酵母菌S7的鋅吸附量和生物量均隨著鋅質(zhì)量濃度的增加而增加，分析其原因可能是一定量的鋅促進(jìn)了細(xì)胞生長；當(dāng)鋅質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，兩者皆達(dá)到最大，分別為15.78 mg/g、1.426；當(dāng)鋅質(zhì)量濃度＞400 mg/L之后，酵母菌S7的鋅吸附量和生物量都隨鋅質(zhì)量濃度的增加而減少。分析原因可能是鋅離子是生物體內(nèi)很多生物酶的輔助因子，隨著鋅含量的增加而促進(jìn)生長發(fā)育，但酵母菌所能耐受的鋅濃度和滲透壓有限，鋅離子質(zhì)量濃度增加到一定程度反而限制了其生長[20]。所以，確定最佳鋅質(zhì)量濃度為400 mg/L。

2.4 富鋅酵母菌S7培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

以蔗糖質(zhì)量濃度（A）、胰蛋白胨質(zhì)量濃度（B）和鋅質(zhì)量濃度（C）作為自變量，鋅吸附量（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法[28]設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

利用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到自變量與鋅吸附量的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=18.52+1.17A+0.93B+0.41C+0.43AB-1.60AC+1.10BC-4.96A2-3.90B2-4.87C2。

由表3可知，模型的P值＜0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)P值＞0.05，不顯著，表明回歸模型可靠。決定系數(shù)R2值為0.985 2，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj值為0.966 1，均＞0.9，說明擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小。由回歸模型和方差分析可知，一次項(xiàng)A、B和交互項(xiàng)AC、BC對(duì)酵母菌S7鋅吸附量的影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)鋅吸附量的影響極顯著（P＜0.01），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

蔗糖質(zhì)量濃度、胰蛋白胨質(zhì)量濃度、鋅質(zhì)量濃度3個(gè)因素之間交互作用對(duì)酵母菌S7鋅吸附量的影響見圖9。圓形的等高線表示兩因素的交互作用不顯著，而成橢圓形或馬鞍形則表示兩因素有顯著的交互作用。

圖9 各兩因素交互作用對(duì)酵母菌S7鋅吸附量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on zinc adsorption of yeast S7

由圖9可知，蔗糖質(zhì)量濃度（A）和胰蛋白胨質(zhì)量濃度（B）等高線圖呈圓形，表明兩因素間的交互作用不顯著。蔗糖質(zhì)量濃度（A）和鋅質(zhì)量濃度（C）、胰蛋白胨質(zhì)量濃度（B）和鋅質(zhì)量濃度（C）等高線呈橢圓形，表明兩因素之間交互作用較顯著，與方差分析結(jié)果一致。

利用Design-Expert V8.0.6軟件，求出回歸模型的極值點(diǎn)，得到富鋅酵母菌S7的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為蔗糖質(zhì)量濃度82.4 g/L、胰蛋白胨質(zhì)量濃度25.7 g/L、鋅質(zhì)量濃度404.0 mg/L，模型預(yù)測(cè)的最高鋅吸附量為18.66 mg/g。為了便于試驗(yàn)操作，將最優(yōu)培養(yǎng)基組成修訂為蔗糖質(zhì)量濃度82 g/L、胰蛋白胨質(zhì)量濃度26 g/L、鋅質(zhì)量404 mg/L。在此最佳水平下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，酵母菌S7鋅吸附量為18.79 mg/g，生物量（OD600nm值）為1.49，與預(yù)測(cè)值接近，說明該模型可以用于優(yōu)化富鋅酵母培養(yǎng)條件。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的酵母DLY28為研究對(duì)象，通過兩次馴化后得到的一株耐鋅酵母S7，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法確定其富鋅最優(yōu)培養(yǎng)基組分為蔗糖質(zhì)量濃度82 g/L，胰蛋白胨質(zhì)量濃度26 g/L，鋅質(zhì)量濃度404 mg/L，在此優(yōu)化條件下，富鋅酵母S7的鋅吸附量達(dá)到18.79 mg/g，生物量（OD600nm值）為1.49。