高產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的篩選、產酶條件優化及酶學性質研究

張興榮，李 峰，賀連智，徐 慧，譚少君，楊 丹，黃艷紅

（山東省食品發酵工業研究設計院，山東 濟南 250014）

環糊精（cyclodextrin，CD）是由D-吡喃葡萄糖通過α-1,4-糖苷鍵首尾相連而成的環狀低聚糖的總稱[1]，通常含有6～12個葡萄糖基單元，其中研究得較多的是含有6～8個葡萄糖單元的分子，分別為α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精[2]。其中β-環糊精具有獨特分子囊結構[3]，該性質近年來在食品領域中得到廣泛的開拓與應用，如轉化食品的形態、控制食品中香料及香味的揮發釋放速度、改善食品的口感等[4]。

在醬油發酵體系中β-環糊精是由β-環糊精葡萄糖基轉移酶（β-cyclodextringlycosyltransferase，β-CGTase）作用于原料中的淀粉、糖原等物質產生的。醬油中風味化合物有300多種，大多數成分揮發性高且穩定性差[5-6]，β-環糊精能與醬油中的香氣成分、維生素、色素等形成相對穩定的復合物，在一定程度上減少其揮發和氧化[7-8]，還能夠掩蓋醬油發酵過程中產生的不快氣味，改善醬油的品質，此外它同其他糖類共同構成了醬油的體態和甜味，在一定程度上提高了產品的質量[9]。目前，研究較多的產β-CGTase微生物為芽孢桿菌，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[10]、嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alcalophilus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）[11]，而霉菌在這方面的研究較少。米曲霉是醬油生產過程中的重要菌株，該菌生長快較粗放，產酶種類豐富，目前對其的研究也主要集中在果膠酶[12-13]、脂肪酶[14]、蛋白酶[15]、淀粉酶[16]等，鮮有文獻報道其產β-CGTase。

本研究從醬醪中篩選出一株產β-CGTase的霉菌，通過形態觀察及分子生物學技術對其菌種鑒定，采用單因素及響應面法對其產酶培養條件進行優化，并對其所產β-CGTase的酶學性質進行研究，以此為米曲霉產β-環糊精葡萄糖基轉移酶及其在醬油中的應用提供理論基礎和科學的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬醪樣品：山東巧媳婦食品集團有限公司。

1.1.2 培養基

分離培養基[17]：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖2.5 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH，115 ℃滅菌20 min。

篩選培養基[18]：可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L、K2HPO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、Na2CO30.2 g/L、酚酞0.3 g/L、甲基橙0.1 g/L、瓊脂20 g/L，115 ℃滅菌20 min。

種子培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[19]：200 g馬鈴薯洗凈去皮切碎，加1 000 mL蒸餾水煮沸20 min，紗布過濾，加入20 g葡萄糖充分溶解，115 ℃滅菌20 min。

基礎發酵培養基[2]：蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L，K2HPO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，自然pH，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

甲基橙、酚酞、Na2CO3、K2HPO3、MgSO4、淀粉、葡萄糖、環糊精、蔗糖、NH4Cl、（NH4）2SO4、酵母膏、蛋白胨等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混試劑Ⅱ、脫氧核糖核酸（desoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋：世得凱儀器設備（上海）有限公司；HH-BLL-600電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療機械廠；HDB-03HD生物顯微鏡：上海漢德檢測技術有限公司；JD200-3電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：江蘇蘇靖集團有限公司；NSK-2102C恒溫培養箱：上海蘇坤實業有限公司；A200朗基全觸屏PCR儀：廣州飛迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的分離

無菌條件下稱取10 g醬醪于100 mL無菌水中，30 ℃振蕩培養1 h，梯度稀釋后涂布于分離培養基，30 ℃培養72 h，挑選不同形態的霉菌菌落進行劃線，直至形成單菌落，將其劃線于斜面培養基，4 ℃保存。

1.3.2 產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的篩選[20]

初篩：將分離得到的菌株接種于篩選培養基上，30 ℃培養2～3 d，觀察是否出現淡黃色接近無色的斑點，挑選出產透明圈的菌株。

復篩：將初篩得到的菌株接種到種子培養基中，30 ℃、150 r/min培養24 h，按照1%（V/V）的接種量將種子液接種到基礎發酵培養基中，裝液量100 mL/250 mL，30 ℃、150 r/min條件下培養72 h，3 000 r/min離心10 min，制取粗酶液，參照文獻[11]測定酶活。

1.3.3 高產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的鑒定

形態觀察：將篩選得到的菌株接種于分離培養基，30 ℃培養72 h，觀察菌落形態的大小，菌絲的高矮，孢子顏色等狀況，同時制水浸片觀察菌絲體有無橫隔、分生孢子梗、頂囊及分生孢子著生狀況等。

分子生物學鑒定：采用DNA提取試劑盒對篩選菌株的DNA進行提取，以其為模板，通過引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3'）對篩選菌株的5.8 ITS rDNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：模板2 μg，引物ITS4（10 μmol/L）2 μL，引物ITS5（10 μmol/L）2 μL，2×TaqMix 25 μL，加雙蒸水（ddH2O）補充至50 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共32個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經純化后委托鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序，測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST同源性搜索，選同源性較高的模式菌株的5.8 ITS rDNA基因序列，使用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶培養基組成優化

（1）單因素試驗

在基礎發酵培養基的基礎上，采用單因素輪換法，依次考察碳源種類（淀粉、環糊精、葡萄糖、蔗糖）及添加量（0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、氮源種類（蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、氯化銨）及添加量（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%）、Na2CO3添加量（0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%、0.65%）對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗的基礎上進行響應面優化試驗，以β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力（Y）為響應值，以淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）及Na2CO3添加量（C）為考察指標，根據Box-Behnken試驗設計原理，采用3因素3水平響應面分析法對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的培養基組成進行優化，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.5 菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶發酵條件優化

在最佳培養基組成的基礎上，依次考察培養溫度（20℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）及時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響。

1.3.6 菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶酶學性質的研究

（1）不同pH值對酶活性的影響

β-環糊精葡萄糖基轉移酶在不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）的反應體系中進行酶促反應，測定β-環糊精葡萄糖基轉移酶的活性，以最高酶活力為100%，計算相對酶活，確定其最適反應pH值。

（2）不同溫度對酶活性的影響

在最適pH條件下，設置反應體系溫度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃，測定β-環糊精葡萄糖基轉移酶的活性，以最高酶活力為100%，計算相對酶活，確定其最適反應溫度。

（3）不同離子對酶活性的影響

在最適pH及溫度條件下，添加Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+5種離子溶液，調節離子的濃度為2.5 mmol/L，測定β-環糊精葡萄糖基轉移酶的活性，以空白對照的酶活力為100%，計算相對酶活，確定其對酶促反應的影響。

2 結果與分析

2.1 產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株分離及篩選結果

圖1 菌株D5的初篩結果Fig.1 Primary screen results of strain D5

圖2 3株菌所產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的測定結果Fig.2 Determination results of activity of β-CGTase produced by 3 strains

從醬醪中共分離得到5株霉菌，通過初篩得到3株產透明圈的菌株，編號分別為D1、D2、D5，其中菌株D5產生的透明圈見圖1。發酵后測定3株菌株的β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力，結果見圖2。由圖2可知，3株菌株中，菌株D5所產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力最高，為1 814 U/mL，因此，選取β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力最高的菌株D5為目標菌株。

2.2 高產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的鑒定

2.2.1 形態觀察

菌株D5的菌落形態及菌體形態見圖3。由圖3可知，菌株D5在分離培養基上生長迅速，30 ℃培養72 h，菌落直徑為2～3 cm。菌落初期呈白色、黃色，后期變為淡綠褐色，分生孢子頭呈放射狀，孢子呈黃綠色球形，大小均勻。

圖3 菌株D5的菌落（a）及菌體（b）形態Fig.3 Colony (a) and mycelium (b) morphology of strain D5

2.2.2 分子生物學鑒定

基于菌株D5的5.8 ITS rDNA基因序列，使用MEGA 7.0軟件中的NJ法構建系統發育樹，結果見圖4。

圖4 基于5.8 ITS rDNA基因序列菌株D5的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain D5 based on 5.8 ITS rDNA gene sequences

由圖4可知，菌株D5與米曲霉（Aspergillus oryzae）（MH793844.1）聚于一支，親緣關系最近，相似度為98%，結合形態觀察結果，最終鑒定菌株D5為米曲霉（Aspergillus oryzae）。

2.3 菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶發酵培養基組成優化單因素試驗結果

2.3.1 碳源對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響

在基礎發酵培養基的基礎上，4種碳源對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響見圖5。由圖5可知，以淀粉為碳源時，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力最高，為2059.01U/mL，因此選取淀粉為最佳碳源。這與曹新志等[21]對嗜堿芽孢桿菌產環糊精糖基轉移酶最優發酵碳源結果一致。淀粉添加量對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響見圖6。由圖6可知，隨著淀粉添加量的增加，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力呈先升高后下降的趨勢。當淀粉添加量為1.5%時，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力最高，為2 319 U/mL，因此確定最佳淀粉添加量為1.5%。

圖5 不同碳源對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on the activity of β-CGTase produced by strain D5

圖6 淀粉添加量對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.6 Effect of starch addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.3.2 氮源對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響

在最佳碳源的基礎上，考察氮源種類對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響，結果見圖7。由圖7可知，菌株D5能利用無機氮源，但是在添加無機氮源的條件下β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力較低，而添加酵母膏的培養基發酵后，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力最高為2 161.03 U/mL，分析原因可能是酵母膏中富含多種需氨基酸、維生素、核甘酸、多肽及微量元素更適合菌株的生長與產酶。因此選取酵母膏為最適氮源。酵母膏添加量對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響見圖8。由圖8可知，隨著酵母膏添加量的增加，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力呈先升高后下降的趨勢。當酵母膏添加量為1.75%時，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力最高，為2537U/mL，因此確定最佳酵母膏添加量為1.75%。

圖7 不同氮源對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on the activity of β-CGTase produced by strain D5

圖8 不同酵母膏添加量對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.8 Effect of yeast extract addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.3.3 Na2CO3添加量對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響

在最優氮源和碳源的基礎上，考察不同的Na2CO3添加量對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響，結果見圖9。

圖9 Na2CO3添加量對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響Fig.9 Effect of Na2CO3 addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

由圖9可知，隨著Na2CO3添加量的增加，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力呈先升高后下降的趨勢。當Na2CO3添加量為0.35%時，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力最高，為2788U/mL，因此確定最佳Na2CO3添加量為0.35%。

2.4 菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶發酵培養基組成優化響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力（Y）為響應值，淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）及Na2CO3添加量（C）為自變量，根據Box-Behnken試驗設計原理，采用3因素3水平響應面分析法對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的培養基組成進行優化，試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶發酵培養基組成優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation medium component optimization of β-CGTase production by strain D5

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface test results

采用Design-Expert V8.0.6軟件對表2的結果進行回歸性分析，以酶活（Y）為因變量，淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）、Na2CO3添加量（C）為自變量，建立回歸方程：

由表3可知，模型的P＜0.05，顯著，失擬值P＞0.05，不顯著，說明該模型較為適合，試驗點均可用模型描述。此外，決定系數R2為0.991 5，表明該模型有較好的可信度，即該模型能夠很好的解釋發酵培養基組成對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響。由表3亦可知，一次項A及二次項C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B及二次項B2對結果影響顯著（P＜0.05），其他因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。根據離散分析，3個因素的影響顯著性排序為A＞B＞C，即淀粉添加量＞酵母膏添加量＞碳酸鈉添加量。

根據試驗結果建立響應面分析圖，結果見圖10。

圖10 各因素交互作用對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力影響的響應面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the activity of β-CGTase produced by strain D5

由圖10可知，淀粉與酵母膏添加量之間的交互作用對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響最大，其次是淀粉添加量與Na2CO3添加量的交互作用，酵母膏添加量與Na2CO3添加量的交互作用最小，與方差分析結果一致。

由模型計算得到最佳培養基組成為淀粉添加量2.5%，酵母膏添加量1.85%，Na2CO3添加量0.35%，在此優化條件下，菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的酶活為3017.10U/mL。

2.5 菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶發酵條件的研究

2.5.1 發酵溫度對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響

發酵溫度對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響見圖11。由圖11可知，隨著發酵溫度的升高，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力呈先升高后下降的趨勢，溫度對米曲霉的生長狀態有重要影響，溫度較低或較高都會對其生長有抑制作用，其產酶過程也相應的受到抑制。當發酵溫度為30 ℃時，β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力最高，為3 099.17 U/mL。因此，確定最優發酵溫度為30 ℃，這與朱德艷[22]的研究結果一致。

圖11 不同發酵溫度對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.11 Effect of different fermentation temperature on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.5.2 發酵時間對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響

圖12 不同發酵時間對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.12 Effect of different fermentation time on the activity of β-CGTase produced by strain D5

發酵時間對菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶酶活的影響見圖12。由圖12可知，隨著發酵時間的延長β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力逐漸升高；當發酵時間為72 h時，酶活最高為3 208.01 U/mL；隨著發酵時間的延長，營養物質逐漸消耗不利于產酶，因此確定最優的發酵時間為72 h。

2.6 菌株D5產β-環糊精葡萄糖基轉移酶酶學性質研究結果

2.6.1 pH對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響

pH對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響見圖13。由圖13可知，隨著反應體系pH值在3.0～8.5范圍內升高，β-環糊精葡萄糖基轉移酶的活力呈上升趨勢。當反應體系的pH值＞8.5之后酶活開始下降，這表明反應液的pH值太高不利于β-環糊精葡萄糖基轉移酶的催化降解反應，因此確定其酶解的最適反應pH值為8.5，可見該酶是一種堿性β-CGTase。在不同pH條件下底物分子和酶分子的帶電狀態不同，從而影響酶和底物的結合，影響酶的穩定性。孟艷芬等[23]在對芽孢桿菌產生的β-CGTase酶學性質的研究中得出其最適pH值為9.0，同為堿性β-CGTase。

圖13 不同pH值對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.13 Effect of different pH on the activity of β-CGTase

2.6.2 溫度對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響

圖14 不同溫度對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.14 Effect of different temperature on the activity of β-CGTase

在最適pH 8.5的條件下，溫度對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響見圖14。由圖14可知，隨著反應體系溫度在25～50 ℃范圍內升高，β-環糊精葡萄糖基轉移酶的相對酶活呈上升趨勢，當反應體系的溫度＞50 ℃之后，β-環糊精葡萄糖基轉移酶的相對酶活開始下降，這表明溫度太高不利于β-環糊精葡萄糖基轉移酶的催化降解反應，因此確定該酶的最適反應溫度為50 ℃。

2.6.3 金屬離子對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響

金屬離子對β-環糊精葡萄糖基轉移酶的影響見圖15。由圖15可知，Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+對β-CGTase的活力有一定影響，Ca2+對酶活的影響較小，其他離子均對該酶的活力有抑制作用，其抑制程度的大小分別為Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+，與孟艷芬等[23]的研究結果一致。

圖15 不同金屬離子對β-環糊精葡萄糖基轉移酶活力的影響Fig.15 Effect of different metal ions on the activity of β-CGTase

3 結論

本研究從醬醪中篩選得到一株高產β-環糊精葡萄糖基轉移酶（β-CGTase）菌株D5，通過形態觀察及分子生物學鑒定其為米曲霉（Aspergillus oryzae），采用單因素輪換法和響應面法對該菌產酶培養基組成進行優化，得出最佳培養基組成為淀粉2.5%、酵母膏1.85%、Na2CO30.35%、K2HPO40.02%、MgSO4·7H2O0.02%，最佳發酵溫度為30℃，發酵時間為72 h，在此最優發酵條件下，β-CGTase活力為3 208.01 U/mL。β-CGTase的最適反應溫度為50 ℃、最適反應pH值為8.5，除Ca2+外，Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+對該酶的活力有抑制作用，其抑制程度大小為Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+。β-CGTase是醬油發酵體系中研究較少的一種酶類，米曲霉產β-CGTase的研究能夠指導醬油的釀造過程，對改善醬油的品質有重要意義。