硫胺素對魯氏接合酵母高鹽適應性的影響

姚婉婷，李 可，宋 娜，王 慧，盧慧芳，陳 雄，李 沛，姚 娟，代 俊

（1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

醬油因其獨特、渾厚、濃郁的風味，在食品調味方面起著十分重大的作用，已成為東方飲食的主要調味品之一[1]。酵母是產風味物質的主要微生物，在醬油釀造過程中，具有產醇、產香、增鮮等作用[2]。然而高鹽稀態釀造醬油是在高鹽條件下進行的，因此提高醬油酵母的高鹽適應性，是醬油產生高風味成分的關鍵因素之一[3]。魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一種常用于醬油發酵的耐鹽芳香型酵母，能代謝產生醇、醛和酯，影響發酵醬油的風味[4]。然而醬油釀造過程中的鹽脅迫會減少Z.rouxii的細胞生長并影響其發酵性能，減少風味的產生。

為了加速發酵過程中香味物質的形成，需要提高增香酵母的生物量控制發酵過程。因此，提高Z.rouxii的高鹽適應性對于增強醬油發酵至關重要。Z.rouxii在鹽脅迫下表現為胞內積累鈉離子脅迫和滲透壓脅迫[5]，其耐鹽機制主要有：一是產生胞內滲透壓調節物；二是通過Na+/K+-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶和Na+/H+反轉運蛋白調節胞內陽離子的動態平衡[6]。研究表明，細胞會采取一些策略來抵御鹽脅迫，如調節細胞內微環境、細胞膜和細胞代謝等[7]。硫胺素即維生素B1（vitamin B1，VB1），是所有生物體的重要化合物，其功能形態焦磷酸硫胺素（thiamine diphosphate，TDP）在細胞代謝中的行使多種輔助功能[8]。據報道，TDP依賴性酶如轉酮酶或α-酮戊二酸脫氫酶影響細胞氧化還原狀態[9]。LUKIENKOP I等[10]研究發現，硫胺素能發揮更直接的作用，其能與自由基潛在相互作用而被氧化，導致三環硫色素（tricyclic thiochrome）的形成，顯示出抗氧化性質。

本研究通過額外添加一定量的硫胺素，研究Z.rouxii菌株的生理代謝過程，從而探討在高鹽脅迫下，硫胺素對魯氏接合酵母高鹽適應性的影響，以期為增加食品工業醬油的風味品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）CCTCC M2013310：湖北工業大學功能酵母與釀造微生物研究室[4]。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20 g/L。固體培養基中加入瓊脂20 g/L。

1.1.3 試劑

酵母浸粉（生化試劑）：賽默飛世爾科技有限公司；葡萄糖（生化試劑）、氯化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京雙旋微生物培養基制品廠；硫胺素、三氯乙酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；液體樣本甘油含量酶法測定試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司；腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

WFJ2000型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；YXQ-LS-100SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；5810R型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SBA-90型生物分析傳感儀：山東省科學院生物研究所；7890B型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：安捷倫科技（中國）有限公司；ZA3300型原子吸收光譜儀：日本HITACHI公司；Ultimate 3000型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魯氏接合酵母種子液的制備

將魯氏接合酵母接種于5 mL YEPD培養基，30 ℃、200r/min條件下培養24h，按5%（V/V）的接種量接種于YEPD培養基，裝液量50 mL/250 mL，30 ℃、200 r/min條件下培養12 h，作為二級種子液備用。

1.3.2 硫胺素濃度的確定

由于Z.rouxii在含180 g/L NaCl的YEPD平板上生長狀態較差，因此，選用含140 g/L NaCl的YEPD平板探究不同質量濃度硫胺素的添加對魯氏接合酵母生長的影響。

將二級種子液采用10倍梯度稀釋法稀釋至10-1、10-2、10-3，在加入不同質量濃度硫胺素（0、0.5 mg/L、5 mg/L、50 mg/L、0.5 g/L、5 g/L、10 g/L）的含140 g/L NaCl YEPD固體培養基平板上點樣0.8 μL，30 ℃靜置培養60 h，觀察菌落的生長情況。

1.3.3 高鹽脅迫下魯氏接合酵母顯微形態觀察

將二級種子液按5%（V/V）的接種量分別接種于含有180 g/L NaCl的50 mL YEPD培養基（對照組）、含有5 g/L硫胺素和180 g/L NaCl的50 mL YEPD培養基中（試驗組），30 ℃、200 r/min條件下發酵，取不同生長階段的發酵液備用。取適量發酵液涂布于載玻片中央，蓋上蓋玻片在微分干涉對比（differential interference contrast，DIC）顯微鏡下觀察酵母的形態特征。

在載玻片中央滴加一滴1 g/L亞甲藍染液，取適量待觀察菌液置于染液中，混勻后放置3 min，在明場（bright field，BF）鏡頭下觀察細胞并根據細胞顏色區分死活細胞。

細胞周期中取樣點的確定：首先根據菌株不同培養條件下的生長曲線確定其生長周期各階段；再根據細胞在不同培養條件下細胞周期階段中相似的時間點取樣。對照組：延滯期時取樣時間點為12 h、對數期取樣時間點為36 h、穩定期取樣時間點為72 h；試驗組：延滯期取樣時間點為12 h、對數期取樣時間點為24 h、穩定期取樣時間點為72 h。

1.3.4 測定方法

生物量的測定：OD600nm值的測定：取5 mL發酵液，5 000 r/min離心10 min，取其上清液作為參比液，在波長600 nm處測定OD600nm值。細胞干質量的測定：稱取離心管的質量，取5 mL發酵液于離心管中，5 000 r/min離心10 min，用清水洗滌2次后于80 ℃烘箱內烘干至恒質量，電子天平稱離心管和菌體的質量，計算出每毫升發酵液的細胞干質量。

葡萄糖含量的測定[11]：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dini trosalicylic acid，DNS）法。

乙醇濃度的測定[12]：使用SBA-40C生物傳感器。

甘油含量的測定[13]：將發酵液于12 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液待測胞外甘油含量，菌體用去離子水清洗3次后加入1 mL超純水，加入適量玻璃珠用渦旋儀破碎10 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液待測胞內甘油含量。使用液體樣本甘油含量酶法測定試劑盒測定甘油含量。

胞內海藻糖含量的測定[14]：將發酵液于12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，收集菌體，用無菌水清洗3次，菌體用0.5 mol/L的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）常溫下提取3次，每次20 min。收集3次提取液，稀釋后用硫酸蒽酮法測定其中的海藻糖含量。

胞內鈉鉀比率（Na+/K+）的測定[15]：采用HITACHI原子吸收光譜儀測定胞內的鈉和鉀離子的濃度。

Na+/K+-ATP酶活性的測定：采用ATP酶試劑盒[16]。

脂肪酸的測定：參照文獻[17]采用GC法。

2-苯乙醇含量的測定：參照文獻[18]采用HPLC法。

1.3.5 統計分析

實驗重復3次，結果用“平均值±標準差”表示，用Origin 9.0軟件作圖，采用Excel 2010進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度硫胺素對魯氏接合酵母生長的影響

硫胺素通過TDP依賴性酶如轉酮酶或α-酮戊二酸脫氫酶影響細胞氧化還原狀態和與自由基的潛在相互作用參與不同抗脅迫的生化反應[19]。由于Z.rouxii在含180 g/L NaCl的YEPD平板上生長狀態較差，因此選用含140 g/L NaCl的YEPD平板探究不同質量濃度硫胺素的添加對魯氏接合酵母生長的影響，結果見圖1。由圖1可知，外源添加5 g/L、10 g/L的硫胺素對Z.rouxii細胞生長的促進作用最大，而添加其他質量濃度的硫胺素，促進作用不明顯。因此，選擇外源添加5 g/L硫胺素考察其對Z.rouxii耐鹽脅迫機制的影響。

圖1 不同質量濃度硫胺素對魯氏接合酵母生長的影響Fig.1 Effect of different concentrations of thiamine on growth status of Z.rouxii

2.2 高鹽脅迫下魯氏接合酵母的形態特征

當細胞所處的外環境滲透壓驟升時，水分會迅速流向低水分活度的胞外環境，細胞收縮[20]。使用蔡司顯微鏡DIC觀察Z.rouxii細胞在有無5 g/L硫胺素添加的含180 g/L NaCl YEPD培養基中不同生長階段的形態變化，結果見圖2。

由圖2可知，Z.rouxii細胞不運動，以出芽方式進行無性繁殖，在延滯期的形狀趨于球形，直徑＜5 μm，細胞表面出現褶皺，有許多細胞聚集成團。細胞的相對表面積增大，有利于細胞的物質交換從而保護細胞。在對數期，細胞拉長呈橢球形，短徑約5 μm，細胞表面光滑，出芽率高。在穩定期，對照組的Z.rouxii細胞大部分呈單細胞狀態，出芽現象不明顯；而添加5 g/L硫胺素的Z.rouxii細胞仍存在出芽現象，細胞表面更加圓潤飽滿。說明在180 g/L NaCl的脅迫下，外源添加硫胺素可能會增加細胞活力，延緩細胞的衰老。

圖2 對照組（a）及試驗組（b）魯氏接合酵母不同生長階段的細胞形態Fig.2 Cell morphology of Zygosaccharomyces rouxii at different growth stages in control group (a) and test group (b)

使用顯微鏡BF觀察Z.rouxii細胞分別在有無5 g/L硫胺素添加的含180 g/L NaCl YEPD培養基中不同生長階段的亞甲藍染色情況，結果見圖3。

圖3 對照組（a）及試驗組（b）魯氏接合酵母不同生長階段的亞甲藍染色情況Fig.3 Results of methylene blue staining of Zygosaccharomyces rouxii at different growth stages in control group (a) and test group (b)

由圖3可知，Z.rouxii細胞在延滯期和對數期細胞活力較強，幾乎不被染色；在穩定期，部分細胞呈藍色或淡藍色。與添加硫胺素的試驗組相比，對照組中死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞數目更多。在一定程度上說明了外源添加硫胺素增加了Z.rouxii細胞對高鹽脅迫的適應性，延緩了細胞的衰老。

2.3 硫胺素的添加對魯氏接合酵母細胞生長和葡萄糖消耗的影響

Z.rouxii發酵利用葡萄糖的過程有3種途徑，有氧呼吸生成CO2和H2O，無氧呼吸生成乙醇或者生成甘油[21]。探究硫胺素的添加對Z.rouxii細胞的生長和葡萄糖消耗的影響，結果見圖4。

圖4 硫胺素添加對魯氏接合酵母細胞生長和葡萄糖消耗的影響Fig.4 Effect of thiamine addition on growth and glucose consumption of Zygosaccharomyces rouxii cells

由圖4可知，對照組中，Z.rouxii經過24 h的延滯期后細胞快速生長。與對照組相比，試驗組中葡萄糖的消耗更迅速，Z.rouxii細胞的延滯期縮短了12 h，穩定期時生物量提高了7.1%。試驗組在12 h之前，雖然葡萄糖在消耗，但生物量增加較少；在12 h之后隨著葡萄糖的消耗，生物量迅速增加。這種現象表明，硫胺素的加入促進了葡萄糖的消耗；在延滯期，葡萄糖的消耗可能不是用于細胞的生長而是用于合成平衡細胞滲透壓的物質。胞內生物相容性的物質有甘油和海藻糖等，其可以提高酵母在高滲透壓下的生長，硫胺素是否促進葡萄糖的分解代謝用于合成甘油和海藻糖需要進一步探討。

2.4 硫胺素的添加對魯氏接合酵母乙醇產量的影響

乙醇對于醬油香氣的形成有重要作用。優化醬油酵母產乙醇條件，提高醬油中乙醇產量，有利于醬油的增香和保存[22]。硫胺素的添加對魯氏接合酵母乙醇產量的影響見圖5。

圖5 硫胺素的添加對魯氏接合酵母乙醇產量的影響Fig.5 Effect of thiamine addition on ethanol yield of Zygosaccharomyces rouxii

由圖5可知，乙醇在對數生長期開始積累，當葡萄糖消耗完全時達到最大濃度。對照組中，乙醇產量最大達到2.77 g/L；與對照組相比，添加硫胺素后，乙醇產量最大達到4.5 g/L，比對照組高62.5%。硫胺素焦磷酸在丙酮酸脫羧酶催化丙酮酸脫羧形成乙醛的反應中行使輔助因子功能，促使更多的乙醛還原成乙醇。因此，在高鹽脅迫下，外源添加硫胺素能提高Z.rouxii的乙醇產量。

2.5 硫胺素的添加對魯氏接合酵母甘油和胞內海藻糖含量的影響

在Z.rouxii中甘油和海藻糖是重要的生物相容性物質。甘油由于含有羥基，親水性能好，能有效地維持細胞內水分活度，保護細胞免受脫水的侵害，平衡高鹽引起的細胞內外滲透壓[23]。海藻糖是酵母細胞高滲透壓下的一種典型代謝物質，可以保護細胞膜、蛋白質、核酸和其他生物大分子免受脅迫損傷[12]。硫胺素的添加對Z.rouxii胞內外甘油含量的影響見圖6。

圖6 硫胺素的添加對魯氏接合酵母胞內（A）、胞外（B）甘油含量的影響Fig.6 Effect of thiamine addition on intracellular (A) and extracellular(B)glycerol contents of Zygosaccharomyces rouxii

由圖6可知，對照組中，Z.rouxii在前30 h的適應階段，胞內甘油的含量都隨著葡萄糖的消耗而有效的合成，在30 h時達到最大積累量（81 mg/g菌體干質量），在30 h之后細胞進入快速生長階段，胞內積累的甘油被迅速消耗，可能是用于脂類合成或其他保護性物質的合成。試驗組中，Z.rouxii菌體胞內甘油在前12 h積累并達到最大積累量（75 mg/g菌體干質量），之后也迅速減少，但每克干菌體細胞的最大胞內甘油積累量與對照相比無顯著差異（P＞0.05）。說明外源添加硫胺素能促使高滲甘油應答途徑[23]中甘油合成的提前，確保遲滯期細胞產生較多的胞內甘油，以平衡細胞內外的滲透壓，使細胞能盡快適應高鹽環境。

由圖6亦可知，試驗組中Z.rouxii胞外甘油積累速率比對照組更快，最高含量比對照組高59.7%。胞外甘油在細胞生長延滯期積累，在生長對數中期開始消耗，當葡萄糖消耗完時，積累的胞外甘油也消耗完畢。結合胞內外甘油的產量，說明外源添加硫胺素能促進甘油的合成，至于胞外甘油對Z.rouxii在高鹽脅迫下能否起到更為長期的保護作用需要進一步的研究。

硫胺素的添加對Z.rouxii胞內海藻糖含量的影響見圖7。海藻糖作為一種典型應激代謝物，其合成分解在Z.rouxii胞內是可調控的。由圖7可知，與對照組相比，添加了硫胺素的培養基中，海藻糖作為碳源被分解代謝的速率更快，更有效的參與細胞的生長代謝過程，這可能是由于硫胺素促進了糖異生的代謝。在高鹽脅迫下Z.rouxii胞內海藻糖積累現象不明顯可能是更多的碳通量流向高滲甘油應答途徑或者此時細胞內又產生其他具有保護性的物質。

圖7 硫胺素的添加對魯氏接合酵母胞內海藻糖含量的影響Fig.7 Effect of thiamine addition on intracellular trehalose content of Zygosaccharomyces rouxii

在高鹽脅迫條件下，酵母會產生相容性滲透調節物對抗脅迫，它們的主要作用是保持水平衡、穩定酶系統正常代謝功能以及恢復正常細胞容積。甘油和海藻糖是常見的兩種重要滲透調節物，也是酵母對抗高滲脅迫的主要方式。根據實驗結果，相比于海藻糖，Z.rouxii主要是依靠甘油的產生和富集來適應高鹽脅迫。特別是在硫胺素添加的鹽脅迫條件下，Z.rouxii胞內甘油含量在遲滯期末達到最高值的時間比對照組提前了18 h，表明這段時期的細胞迅速產生甘油來平衡滲透壓，使其迅速適應環境；當細胞適應了環境后，胞內甘油也慢慢降到一個平衡點，此時細胞生長已趨于穩定；胞內甘油生產的增加，也伴隨著甘油的溢出，這導致胞外甘油含量持續增加至對數生長期中后期；當葡萄糖被消耗完全后，作替代碳源和能量來源的甘油也隨之減少。而Z.rouxii胞內海藻糖在硫胺素添加的鹽脅迫條件下，一直呈減少趨勢，在32 h消耗至最低，且消耗速率快于對照組；值得注意的是，海藻糖在Z.rouxii胞內沒有富集，而是作為一種儲存性的碳源被消耗，在葡萄糖消耗完全時，胞內的海藻糖的含量也達到最低水平。在對照組中，甘油和海藻糖的代謝趨勢也與實驗組類似。上述結果表明，Z.rouxii在面臨鹽脅迫時會產生并富集甘油而不是海藻糖來適應脅迫，而硫胺素的添加，能促進甘油的有效合成，加快海藻糖的代謝，使細胞能更快適應高鹽脅迫條件。

2.6 硫胺素的添加對魯氏接合酵母胞內Na+/K+及Na+/K+-ATP酶活性的影響

ATP酶是一類分布廣泛的膜結合蛋白酶，其中Na+/K+-ATP酶在維持細胞內外滲透壓的平衡與細胞膜完整性中起到了重要的作用[16]。Z.rouxii在高鹽脅迫的環境中，胞內Na+的濃度要遠高于K+的濃度。當Z.rouxii細胞膜上Na+/K+-ATP酶被激活時，會將細胞內的Na+轉運到細胞外，同時將細胞外的K+轉運到細胞內，維持細胞內外滲透壓的平衡。硫胺素添加對Z.rouxii胞內鈉鉀比率（Na+/K+）及細胞膜上Na+/K+-ATP酶活性的影響見圖8。

圖8 硫胺素的添加對魯氏接合酵母胞內Na+/K+（A）及細胞膜上Na+/K+-ATP酶活性（B）的影響Fig.8 Effect of thiamine addition on Na+/K+(A) in cell and Na+/K+-ATP enzyme activity (B) on cell membrane of Zygosaccharomyces rouxii

由圖8可知，Z.rouxii胞內Na+/K+在對數期降低，在穩定期有所升高。在對數期，添加硫胺素的培養基中胞內Na+/K+為43.6，比對照組低11.3%。相反，試驗組中Z.rouxii細胞膜上Na+/K+-ATP酶的活性在對數期升高，在穩定期有所下降。這是因為在細胞受到外界脅迫時，細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基含量會升高，隨著時間的延長，Z.rouxii胞內產生過量的ROS會導致膜的氧化損傷，使Na+/K+-ATP酶活性出現下降，胞內Na+/K+升高，最終導致細胞活性下降甚至進入凋亡[24]。Z.rouxii在延滯期的Na+/K+-ATP酶活性很低，為0.004 U/mg蛋白，這可能與延滯期菌體生物量少，菌體未適應脅迫條件，酶活被抑制有關。在對數期，添加硫胺素的培養基中Na+/K+-ATP酶活性為0.91 U/mg蛋白，比對照組高361.6%；在穩定期，添加硫胺素的培養基中Na+/K+-ATP酶活性為0.59 U/mg蛋白，比對照組高111.4%（P＜0.05）。在高鹽脅迫下，外源添加硫胺素能增加Na+/K+-ATP酶活性，降低胞內Na+/K+，減少Na+對細胞的毒害作用從而增加細胞活性。

2.7 硫胺素添加對魯氏接合酵母胞內脂肪酸組成的影響

脂肪酸鏈的飽和度影響著細胞膜的流動性和滲透性[25]，因此，脂肪酸的合成將影響Z.rouxii在含180 g/L NaCl YEPD培養基中的生長。硫胺素添加對魯氏接合酵母胞內脂肪酸組成的影響見表1。

表1 硫胺素的添加對魯氏接合酵母胞內脂肪酸組成的影響Table 1 Effect of thiamine addition on fatty acid composition in Zygosaccharomyces rouxii cell

由表1可知，Z.rouxii胞內的脂肪酸主要有棕櫚酸（C16：0）、棕櫚油酸（C16：1）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）和亞油酸（C18：2）。對照組中，Z.rouxii胞內主要不飽和脂肪酸的含量是總脂肪酸含量的81.07%，主要飽和脂肪酸的含量為17.92%。添加硫胺素的培養基中，Z.rouxii胞內主要不飽和脂肪酸含量是總脂肪酸含量的57.82%，主要飽和脂肪酸的含量是36.49%。

與對照組相比，添加硫胺素后，Z.rouxii細胞內棕櫚油酸（C16：1）、油酸（C18：1）和亞油酸（C18：2）含量分別減少1.21%、17.56%和4.48%，月桂酸（C12：0）、豆蔻酸（C14：0）、棕櫚酸（C16：0）和硬脂酸（C18：0）含量分別增加0.42%、1.12%、10.24%和6.79%，飽和脂肪酸含量提高18.57%，而不飽和脂肪酸含量減少23.25%。外源添加硫胺素使Z.rouxii通過改變脂肪酸的組成，降低不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例，從而提高了脂肪酸的飽和度，增加了細胞膜的穩定性，避免酵母細胞出現內外滲透差而導致膜的破裂，保證了細胞膜的流動性，使得細胞在高鹽脅迫下能夠更好的生長。

2.8 硫胺素的添加對魯氏接合酵母2-苯乙醇產量的影響

Z.rouxii在發酵過程中產生乙醇、高級醇（如2-苯乙醇）及芳香雜醇類物質，在高鹽環境中還能轉化糖類物質生成多元醇（如甘油）及糖醇類風味物質[26]。2-苯乙醇是發酵食品中具有玫瑰風味的重要風味成分之一，若醬油中不含或少含2-苯乙醇類的高級醇，會使醬油味淡薄，風味不足。硫胺素的添加對魯氏接合酵母2-苯乙醇產量的影響見圖9。

圖9 硫胺素的添加對魯氏接合酵母2-苯乙醇產量的影響Fig.9 Effect of thiamine addition on 2-phenylethanol production of Zygosaccharomyces rouxii

由圖9可知，對照組中，Z.rouxii在延滯期的2-苯乙醇產量為4.7 mg/L，對數期的2-苯乙醇產量為0.04 g/L，穩定期的2-苯乙醇產量為0.05 g/L。添加硫胺素后，Z.rouxii在延滯期的2-苯乙醇產量為5.2 mg/L，對數期的2-苯乙醇產量為0.05 g/L，穩定期的2-苯乙醇產量為0.07 g/L。與對照組相比，添加了硫胺素使Z.rouxii的2-苯乙醇產量在對數期提高了17.9%，在穩定期提高了35.3%。在延滯期，無論是否添加硫胺素，因為菌體正處在對環境的適應階段，細胞生長緩慢，生物量少，代謝產生的2-苯乙醇量低，所以兩者變化不明顯。

在氮源豐富的條件下，細胞只能通過莽草酸途徑合成少量的2-苯乙醇[27]。莽草酸途徑中，來源于糖酵解途徑的磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途徑的4-磷酸赤蘚糖經一系列酶促反應生成2-苯乙醇[28]。硫胺素焦磷酸在3-磷酸甘油醛生成4-磷酸赤蘚糖的轉酮酶反應中行使輔助因子功能，因此，在高鹽脅迫下，外源添加硫胺素能提高2-苯乙醇在莽草酸途徑上的產量。

3 結論

研究結果表明，外源添加硫胺素（5 g/L）增加了Z.rouxii細胞對高鹽脅迫的適應性，增加了細胞活力，延緩了細胞的衰老；使高鹽脅迫下細胞的延滯期縮短了12 h，生物量提高了7.1%；促進葡萄糖的分解代謝，使高滲甘油應答途徑中甘油的合成提前并提高甘油的產量；促進海藻糖分解代謝參于細胞的生長代謝過程；增加了Na+/K+-ATP酶活性，降低了胞內Na+/K+，減少Na+對細胞的毒害作用從而增加細胞活性；通過改變脂肪酸的組成，降低不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例，從而提高脂肪酸的飽和度，保證細胞膜的流動性，維持細胞在高鹽脅迫下的生長。除此之外，硫胺素的添加還提高了62.5%的乙醇產量以及提高了35.3%的2-苯乙醇產量，有利于醬油的增香和保存，提高醬油的風味品質。

由此可見，硫胺素能增強Z.rouxii的高鹽適應性，提高鹽脅迫條件下的生物量，加速發酵過程中風味物質的形成，結果將有助于探索醬油發酵過程中耐鹽產香酵母風味形成的機理，并改善傳統醬油釀造的營養與風味。