基于高通量測序分析不同瀏陽豆豉中真菌的多樣性

陳 怡，劉 洋，蔣立文，李 跑，廖盧艷

（1.湖南農業(yè)大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

豆豉是一類深受消費者喜愛的發(fā)酵豆制品，其發(fā)酵過程中產生了活性肽、大豆低聚糖、大豆異黃酮、類黑精等一系列的活性物質[1-4]，使豆豉具有抗癌、抗氧化及促進免疫調節(jié)等一系列的生理活性[5-8]，同時也賦予其獨特的風味和藥用價值[9-11]。豆豉按照其優(yōu)勢發(fā)酵菌群的不同可分為毛霉型、曲霉型、根霉型、細菌型4種[12-13]，且均有各自的代表產品，如永川豆豉、瀏陽豆豉以及印尼丹貝和日本納豆等。納豆和丹貝均屬于單菌種發(fā)酵豆豉[14-15]，這類豆豉產品具有質量穩(wěn)定、發(fā)酵過程容易控制等優(yōu)點，但在我國食用與生產較少。我國豆豉以曲霉型豆豉及毛霉型豆豉為主，均為自然發(fā)酵，發(fā)酵期間菌群復雜多樣、具有獨特風味，但形成機理不明確，且產品質量不穩(wěn)定且難以調控。

高通量測序技術是現(xiàn)在較為先進的技術之一，在發(fā)酵食品微生物組成分析中應用廣泛。LIANG J J等[16]研究發(fā)現(xiàn)，泡菜的微生物群落處于優(yōu)勢地位由三個屬的成員組成：白串珠菌屬、乳酸菌屬和威塞拉屬。腐乳發(fā)酵中亦鑒定出50種細菌和99種真菌，涉及的細菌群落主要是不動桿菌屬，腸球菌和鏈球菌；而真菌（曲霉和紅曲霉），在發(fā)酵后階段約占整個菌群的95%[17]。MIN J K等[18]對共14種韓國豆豉樣品進行菌群分析，得出關鍵的微生物有乳酸桿菌、腸球菌、芽孢桿菌。HE B等[19]則發(fā)現(xiàn)毛霉型豆豉在第一天時以曲霉屬（97.98%）和鏈球菌屬（1.11%）為主，而曲霉豆豉在發(fā)酵第一天時曲霉屬（67.34%）和念珠菌（28.23%）占主導地位；而隨著發(fā)酵時間的增加，曲霉型豆豉中曲霉菌的占比增加，而毛霉型豆豉中曲霉屬的占比下降。

瀏陽豆豉是典型的曲霉型淡豆豉，因其獨特的風味廣受人們喜愛，是湘菜中不可或缺的一種調味料。其以泥豆或小黑豆為原料，制作方法為黑豆清洗、蒸煮、冷卻、自然制曲、洗霉、堆積發(fā)酵、發(fā)酵后熟、成品。不同于大多數(shù)曲霉豆豉，瀏陽豆豉發(fā)酵過程中不加入食鹽，屬于藥食兩用的淡豆豉。且由于發(fā)酵過程中主要的微生物來源于環(huán)境，因此不同生產廠家的產品的微生物的組成和種類存在一定差異。為明確瀏陽豆豉中主要的優(yōu)勢微生物，本試驗通過內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術對4種不同品牌的瀏陽豆豉進行分析，以闡明不同品牌的瀏陽豆豉的真菌群落情況，為瀏陽豆豉工業(yè)生產提供理論基礎和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

瀏陽梁嘉豆豉（LJ）：湖南梁嘉食品有限公司；瀏陽太平橋豆豉（TPQ）：瀏陽市太平橋食品豆豉廠；瀏陽天馬山豆豉（TMS）：瀏陽市天馬山豆豉廠；瀏陽一品香豆豉（YPX）：湖南省瀏陽市一品香豆豉總廠。所有樣品均來源于同一個季節(jié)各品牌企業(yè)發(fā)酵成熟曲料，在整個制作場地的四個角和中心位置取樣后混合（一式三份）共1 kg左右，冷鏈運輸帶回實驗室，分別置于-80 ℃保存待測。

1.2 儀器與設備

SW-CJ凈化工作臺：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHP120恒溫培養(yǎng)箱：上海實驗儀器廠有限公司；TP-620A型電子天平：湘儀天平儀器設備有限公司；LGJ-10真空冷凍冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA提取

在同一品牌樣品的3份取樣袋中各取5 g豆豉混合，放入研缽中，倒入適當?shù)囊旱⒓囱心┏煞勰睿?.1～0.3 g作為待測樣本按照土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒說明書進行基因組DNA抽提，再利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度，同時利用NanoDropOne檢測DNA的濃度和純度。

1.3.2 聚合酶鏈式反應擴增

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增及產物電泳檢測則以基因組DNA為模版，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶barcode的引物及PremixTaq（TaKaRa）進行PCR擴增。利用GeneToolsAnalysisSoftware（Version4.03.05.0，SynGene）對PCR產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算個樣品所需體積，將各PCR產物進行混合。對真菌ITS2區(qū)域進行擴增，選用引物fITS7（GTGARTCATCGAATCTTTG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGCPCR）。PCR反應成分：Phusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL，正向引物2.5 μL，反向引物2.5 μL，模版DNA 50 ng，最后向反應液中加入ddH2O 至總體積25 μL；反應條件：（循環(huán)次數(shù)）35×（95 ℃、30 s；退火溫度54 ℃、30 s；延伸溫度72 ℃、45 s）72 ℃、10 s，維持4 ℃直到結束。

1.3.3 Illumina Miseq測序和數(shù)據(jù)處理

使用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒回收PCR混合產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。后續(xù)建庫按照NEBNext?UltraTMDNA Library Preo Kit for Illumina?標準流程進行建庫操作，完成后以高通量測序平臺Hiseq或Miseq對其進行上機測序（廣東美格基因科技有限公司），測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經堿基識別（Base Calling）分析轉化為原始測序序列（Raw Reads），結果以FASTQ（簡稱為fq）文件格式儲存，其中包含測序序列（Reads）的序列信息以及其對應的測序質量信息。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用PEAR軟件對雙端序列進行拼接，嵌合體序列過濾采用Vsearch（v2.3.4，Vsearch）軟件。去除reads的引物序列（非高變區(qū)），將每一對paired-end reads拼接合并成一條更長的tag。對測序reads進行窗口法質量掃描，掃描窗口默認為100 bp，當窗口內平均質量值低于20時，將read從窗口起始到3'終止的部分截掉，去除截短后長度小于100 bp的序列，且去除截短后N（不確定模糊堿基）的含量在5%以上的序列以及嵌合體序列。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

物種注釋、豐富度等數(shù)據(jù)分析結果均采用GraphPad Prism 5 軟件統(tǒng)計及繪圖。

2 結果與分析

2.1 樣品中真菌群落共享和獨有的操作分類單元和韋恩圖分析

圖1 豆豉樣品韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Douchi samples

通過對真菌ITS1和ITS2區(qū)進行測序，從12個樣本中得到1 234 222條序列，累計496個操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。由圖1可得，樣品種真菌OTUs總數(shù)分別為LJ（347）、TPQ（377）、YPX（361）、TMS（350），其中有146個OTUs是4種豆豉共有的。

2.2 豆豉中真菌多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性，常用的度量標準包括反應群落豐度的：Sobs、Chao、Chao1、Ace、Richness和用來反應群落多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等[20]。據(jù)表1可得，YPX的Shannon指數(shù)最高（2.32）而樣品TMS則最低（1.24）。Chao1與Richness指數(shù)的變化趨勢一致，均顯示TPQ最高，分別為209.77、207.00，說明TPQ樣品的真菌豐度最大，其次是YPX，而TMS則是最低的樣品（分別為184.13、180.33）。

表1 真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indexes of fungi

基于Kruskal-Wallis秩和檢驗的真菌多組間差異結果見圖2。據(jù)圖2可知，TPQ的上邊緣與下邊緣距離最大，表明其平行組間差異較大，這可能與其在發(fā)酵期間受到外界雜菌侵染有關。YPX、TMS以及LJ上下邊緣差距較小，說明樣品中真菌分布較均勻。綜上所述，雖然TPQ真菌豐度最大，但平行樣品間存在較大差異，TMS的真菌豐度最低，真菌種類較為單一。為進一步了解4種樣品豆豉中真菌情況，對其進行物種群落進行了進一步分析，以明確各樣本中的真菌群落分布。

圖2 基于Kruskal-Wallis秩和檢驗的真菌多組間差異Fig.2 Differences among multiple groups of fungi based on Kruskal-Wallis rank sum test

2.2.2 豆豉中真菌的群落情況

由圖3（a）可知，真菌的門水平上的豐度情況，除未能鑒別的序列以外，4種豆豉樣本均是以子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）為主，其中TPQ、YPX及LJ子囊菌門相對豐度均超過80%。說明雖然發(fā)酵環(huán)境場地不同，非同種品牌的瀏陽豆豉在門水平上具有較高的相似性。此外，TMS的子囊門屬的相對豐度相對較低（29.9%），Unassigned（69.5%）是TMS樣品種的優(yōu)勢真菌，此樣品中大部分的菌未能鑒定，還有待進一步研究。

由圖3（b）可知，除未能鑒別的序列以外，各豆豉樣品在真菌的屬水平上的分布差異較大：TMS優(yōu)勢菌屬主要包括曲霉屬（Aspergillus）；而TPQ中以曲霉屬（Aspergillus）和嗜熱菌屬（Thermomyces）為主要菌屬，其次是小囊菌屬（Microascus），其中嗜熱菌屬相對豐度最高（49.2%）；此外，YPX中的菌屬數(shù)量較其他樣品更豐富，主要有曲霉屬、小囊菌屬、青霉屬（Penicillium）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、單端孢屬（Trichothecium）；LJ中曲霉屬為相對豐度最高，為91.4%，其次是小囊菌屬。石聰?shù)萚21]對瀏陽豆豉中微生物進行試驗后，發(fā)現(xiàn)在前期發(fā)酵過程中，屬水平大量出現(xiàn)了曲霉、青霉、根霉和酵母菌等，后續(xù)還出現(xiàn)了橫梗霉屬、嗜熱菌屬等，其中真菌部分與本實驗相符。此外，瀏陽豆豉發(fā)酵過程中真菌種類既有需要的曲霉、根霉等有益微生物，但也出現(xiàn)了部分青霉屬等可能影響產品質量和安全的微生物，這些微生物對瀏陽豆豉風味形成的貢獻還有待進一步研究。

圖3 真菌群落在門水平（a）和屬水平（b）上的相對豐度比較Fig.3 Comparison of relative abundance of fungal communities at the phylum level (a) and genus level (b)

2.2.3 豆豉中真菌數(shù)量的聚類情況

熱圖可以通過板塊顏色的相似性及差異性來反應多個樣本在各分類水平上群落的組成情況，從物種和樣品兩個層面進行聚類，可以觀察到平行樣品之間會存在差別，不同種之間又存在相同點。據(jù)圖4的聚類結果可知，TPQ的平行組之間存在較大差異與圖1的結果相符合，另外YPX與LJ的真菌組成相似，而與其TMS、TPQ則相差較大。

圖4 真菌在屬水平上的聚類熱圖Fig.4 Cluster heatmap of fungus at genus level

橫坐標反映的是不同菌屬在不同樣品中的存在情況，如嗜熱菌屬（Thermomyces）在TPQ樣品中含量最高，橫梗霉屬（Lichtheimia）則主要存在于TMS與LJ中，曲霉屬（Aspergillus）、單端孢屬（Trichothecium）和根霉屬（Rizopus）均在LJ中含量較高，木霉屬（Trichoderma）、單端孢屬（Tri chothecium）、青霉屬（Penicillium）、毛殼菌屬（Chaetomium）是YPX的特征菌屬。

2.2.4 主坐標分析

主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過一系列的特征值和特征向量進行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，將其表現(xiàn)在坐標里。因此PCo1表示盡可能最大解釋數(shù)據(jù)變化的主坐標成分，PCoA2則解釋余下的變化度中占比例最大的主坐標成分，根據(jù)圖5可知，PCoA 1解釋了數(shù)據(jù)集中總方差的56.9%，而PCoA 2解釋了29.9%。圖5中不同顏色的點屬于不同樣本組，PCoA中橫縱坐標的刻度線表示樣品之間的距離，除開LJ與YPX相靠較近，其他都集中在不同的區(qū)域，說明這4種瀏陽豆豉中LJ與YPX的菌群分布較為靠近，且與其它品牌豆豉的差異很大，這與圖4的熱圖聚類情況相符。由圖5還可知，LJ、YPX的三組平行之間差異較小，而TPQ與TMS組間差異則較大，這說明LJ與YPX樣品中真菌分布較為均勻，后兩者真菌組成情況則不統(tǒng)一，尤其是TPQ組間差異最大，此結果與圖1的箱型圖結果相符。

圖5 豆豉樣品的主坐標分析Fig.5 PCoA analysis of Douchi samples

3 結論

本研究探索了不同品牌瀏陽豆豉的真菌組成情況，結果表明：TPQ樣品的真菌相對豐度最大，LJ則較低，YPX樣本中真菌的多樣性高，種類豐富；4種瀏陽豆豉均以子囊菌門、毛霉亞門為主要菌群門類，LJ和YPX中曲霉屬相對豐度最大，分別為91.4%、65.5%，TPQ則以小囊菌屬（49.1%）含量最高。TMS中除未能鑒別的，其次是曲霉屬（29.47%）的相對豐度最高。橫梗霉屬（Lichtheimia）主要存在TMS與LJ中，嗜熱菌屬（Thermomyces）在TPQ樣品中含量最高，曲霉屬（Aspergillus）、單端孢屬（Trichothecium）和根霉屬（Rizopus）均在LJ中含量較高，木霉屬（Trichoderma）、單端孢屬（Trichothecium）、青霉屬（Penicillium）、毛殼菌屬（Chaetomium）則在YPX含量最高；PCoA的結果反映出4種不同品牌的瀏陽豆豉YPX與LJ菌群相似以外，其余樣本相差較大。本研究全面解析了不同品牌瀏陽豆豉中的真菌組成，明確了其中的優(yōu)勢微生物，但瀏陽豆豉生產中微生物影響因素及其對瀏陽豆豉品質的貢獻還有待進一步研究。