山藥酒中甾醇含量測定及清除DPPH自由基活性研究

王晨慧，李春揚，張曉磊*，饒 靜，辛 鵬，李 楠，宋全厚

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；2.國家食品質量監督檢驗中心，北京 100015）

山藥酒是以山藥為主要原料，經酵母菌發酵而成的蒸餾酒、發酵酒，或經蒸餾酒浸提后制成的山藥配制酒，因其可使山藥豐富的營養物質更加完全的溶入酒體，將藥物活性成分最大限度的保留，具有一定滋養強壯，助消化，斂虛汗，止瀉之保健功效，越來越受到消費者喜愛[1-3]。甾醇又稱固醇，是廣泛存在于生物體內的一種重要的天然活性物質，可分為動物性甾醇、植物性甾醇和菌類甾醇等三類[4-5]，動物性甾醇以膽固醇為主，植物性甾醇主要為谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等，而麥角甾醇則屬于菌類甾醇，其中，植物甾醇可降低心血管、癌癥發病率，降膽固醇、促進生長等功效，也是各種植源性食品主要抗氧化活性成分之一[6]。

甾醇作為山藥的標志性活性成分之一，目前其酒類產品的測定方法和含量水平，均未見文獻報導[1]，因此急需建立山藥酒中甾醇含量的測定方法，并對其抗氧化功能進行評價。食品中甾醇類化合物的測定方法有分光光度計法[7]、液相色譜法[8-9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質譜法[11]等。分光光度計法和液相色譜法易受樣品中其他類化合物干擾，氣相色譜法和單級質譜能得到準確定量結果，但靈敏度不夠高。本研究采用氣相色譜串聯質譜法，利用三重四級桿質譜技術的高特異性和強抗干擾能力，大大提升方法靈敏度[12-14]，建立了4種常見植物甾醇和膽固醇同時測定的方法，并以DPPH自由基清除能力為評價指標，對其抗氧化能力進行評價，為深入研究山藥酒的保健功效、提升產品品質，提供技術手段和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥酒（1#山藥蒸餾酒、2#～5#發酵酒、6#～12#露酒）：市售。

5α-膽甾烷醇（內標，純度≥97%）、豆甾醇（純度98.09%）、β-谷甾醇（純度98.05%）、菜油甾醇（純度96.12%）、豆甾烷醇（純度≥98%）、正己烷（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；膽固醇（純度97.2%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；石油醚、氫氧化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：北京化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

TQ8040氣相色譜串聯質譜（gas chromatography tandem mass spectrometer，GC-MS）聯用儀（配備AOC-20i+s自動進樣器）：日本島津公司；Milli-Q Reference超純水系統：美國Millipore公司；Rxi-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Restek公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取一定體積酒樣于蒸發皿中，蒸發濃縮至10 mL轉移到皂化瓶中，依次加入內標物（5α-膽甾烷醇），2 mol/L氫氧化鈉-乙醇溶液50 mL，置于80 ℃恒溫水浴鍋中皂化60 min[15]，冷卻后，轉移至250 mL分液漏斗中，分別用50 mL、50 mL、30 mL石油醚萃取3次，合并有機相，每次加入30 mL去離子水洗滌，直至洗至中性，再經無水硫酸鈉脫水后，于35 ℃水浴中旋轉蒸發至近干，加入200 μL衍生劑（三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷=99∶1，V/V）60 ℃衍生30 min，正己烷定容至1 mL，上機分析。

1.3.2 GC-MS/MS條件

色譜條件[15]：Rxi-5 MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：柱溫200 ℃，以20 ℃/min升至300 ℃，以5 ℃/min升至320 ℃，保持4 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%），流速1 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，能量70 eV；離子源溫度250 ℃；質譜接口溫度280 ℃；溶劑延遲時間5 min；碰撞氣：高純氬氣（Ar）（純度≥99.999%）；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

1.3.3 標準溶液的配制

稱取甾醇類標準品10 mg（精確至0.01 mg）至10 mL容量瓶中，以正己烷溶解并定容，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的甾醇類化合物標準儲備液，再逐級稀釋至一系列質量濃度梯度的混合標準溶液，每一質量濃度梯度的混合標準溶液中加入5 μL 5α-膽甾烷醇內標使用液，使其最終質量濃度均為0.5 μg/L。

1.3.4 清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）能力測定

取不同體積的酒樣，加入1 000 μL DPPH·（濃度為100 μmol/L的乙醇溶液），將其充分混勻后暗處放置30 min后，在波長517 nm處測定吸光度值，同時以2,6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）作陽性對照。計算DPPH·清除率[16-17]。

式中：A0為DPPH溶液+同體積乙醇溶液的吸光度值；Ai為DPPH溶液+樣液的吸光度值；Aj無水乙醇+樣液的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

采用GC-MS/MS MRM模式，設定多個時間段和掃描通道實現對6種甾醇類化合物的同時測定。多反應監測條件見表1。

表1 甾醇類化合物多反應監測條件Table 1 Monitoring conditions for multiple reactions of sterols compounds

圖1 標準溶液（a）及典型樣品（b）的MRM譜圖Fig.1 MRM chromatogram of standard solution (a) and typical samples (b)

由表1可知，通過氣相色譜分離和單級質譜全掃描方式確定各甾醇化合物的出峰順序及保留時間。以多反應監測模式（MRM）為掃描模式，根據目標化合物的保留時間分為3個掃描窗口，使每個時間段的掃描離子對數量適中，調整離子對掃描時間，保證6種甾醇類化合物的同時檢測。標準溶液及樣品的MRM譜圖見圖1。由圖1可知，膽固醇和植物甾醇各組分在11 min內實現良好分離。

2.2 方法學考察

通過線性范圍及相關系數、檢出限和定量限以及相對標準偏差和回收率，對方法進行綜合評估，結果見表2。

表2 甾醇類化合物含量測定方法學評價結果Table 2 Methodological evaluation results of sterols contents determination

由表2可知，各甾醇類化合物標準曲線線性范圍在103.5～57 500 μg/L，相關系數R2均大于0.991，具有較好的線性關系；分別以信噪比為3和信噪比為10時的質量濃度作為檢出限和定量限，其檢出限為0.230～14.48 μg/L，定量限為0.775～48.29 μg/L，高于氣相色譜法和單級氣質聯用技術的靈敏度；分別采用該方法對樣品平行測定6次，其相對標準偏差為0.4%～1.2%；通過添加近等量的標準品，平行測定6次，加標回收率為98.74%～101.3%。上述結果顯示該方法靈敏度高，結果準確可靠，可滿足山藥酒中甾醇化合物定量分析要求。

2.3 樣品分析

利用本研究所建立的方法對山藥酒進行分析，其中包括1種山藥蒸餾酒，4種以山藥為原料的發酵酒和7種山藥露酒，化合物類別和含量詳見表3。

表3 樣品中甾醇類化合物含量測定結果Table 3 Determination results of sterols contents in samples

結果顯示，不同種類山藥酒，其甾醇組成特點相似，均以β-谷甾醇或菜油甾醇含量最高；豆甾醇在山藥發酵酒中含量較高，而其飽和形式——豆甾烷醇在山藥發酵酒中含量較低；山藥酒中均存在一定量的膽固醇，含量為11.08～25.03 μg/L，遠低于牛乳（15 mg/100 g）、瘦牛肉（58 mg/100 g）和鯽魚（130 mg/100 g）等食品中膽固醇含量[18]。以甾醇含量進行比較，不同類山藥酒存在明顯差異：甾醇類化合物總量最高的是山藥蒸餾酒（1#），為1 240.39 μg/L，其中植物甾醇總量為1 218.27 μg/L，膽固醇為22.12 μg/L，發酵酒中甾醇類化合物含量普遍高于配制酒，發酵酒為160.72～1 114.81 μg/L，而配制酒僅為30.15～237.53 μg/L，這可能與酒種的不同工藝（發酵、浸泡）及山藥原料的使用量有關，甾醇含量測定結果可為進一步對山藥酒中甾醇的功效評價提供一定的數據基礎。

2.4 山藥酒DPPH·清除能力的測定

圖2 山藥酒DPPH自由基清除率測定結果Fig.2 Determination results of DPPH free radical scavenging rate in yam alcoholic drinks

利用DPPH法[19-20]對1種山藥蒸餾酒，4種山藥發酵酒和7種山藥露酒進行分析，如圖2所示。結果表明，山藥酒對DPPH自由基均有清除作用，且隨著取樣量增加，清除能力增強，具有良好的量效關系，清除率為0～93.12%；本實驗用半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）值來反映樣液清除DPPH自由基的能力，IC50表示清除自由基50%時溶液的取樣量，其與清除能力呈負相關，IC50值越低，表明清除自由基能力越強，由圖2可知，基酒1#清除DPPH自由基活性能力最強，明顯高于其他樣品，其IC50值為213 μL，接近對照組BHT的IC50值（200 μL），而6#樣品取樣量為1 000 μL時，清除率僅為18.34%，抗氧化能力較低，12種山藥酒抗氧化能力排序為1#＞4#＞2#＞7#＞5#＞3#＞11#＞12#＞10#＞9#＞8#＞6#。

3 結論

本研究建立了同時測定山藥酒中4種常見植物甾醇和膽固醇的GC-MS/MS方法，該方法對甾醇類化合物進行皂化提取，氣相色譜串聯質譜的多反應監測模式測定，對方法進行評估，其相關系數R2≥0.991，檢出限為0.23～14.48 μg/L，定量限為0.775～48.29 μg/L，相對標準偏差小于1.2%，加標回收率為98.74%～101.3%，該方法靈敏度高，可滿足山藥酒中膽固醇和植物甾醇快速同時測定的分析要求。經對部分市售山藥酒中甾醇化合物進行分析和體外抗氧化評價，其甾醇類化合物組成相似，含量存在差異，含量范圍7.52～1 218.27 μg/L。以清除DPPH自由基為指標對山藥酒體外抗氧化能力進行評價，山藥酒均具有一定的抗氧化能力，其中山藥蒸餾酒和發酵酒的抗氧化活性高于山藥配制酒。