高產洛伐他汀紅曲菌的選育及其在紅腐乳中的應用

王 鵬，許春艷，續丹丹，趙 燕，高 航，張 欣，王文平

（1.北京食品科學研究院，北京 100068；2.北京市食品釀造研究所有限責任公司，北京 100050）

紅腐乳是我國北方最具代表性的腐乳產品，以其獨特的氣味、鮮美的滋味、細膩的口感而深受國內外廣大消費者的喜愛[1-2]。與其他類腐乳相比，紅腐乳因其湯料中添加紅曲，顏色通常呈誘人的鮮紅色或棗紅色[3]。紅曲（Monascus）又稱紅曲米、丹曲，是以大米為原料，經紅曲霉（Monascussp.）發酵制成，其顏色呈赤紅色，具有性溫、味甘等特點[4]。紅曲霉是我國重要的傳統食用和藥用微生物，其在發酵過程中能產生紅曲色素及多種有機酸、酯和醇等芳香物質[5]、分泌多種酶如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等[6]，同時能代謝產生洛伐他汀[7]、γ-氨基丁酸[8]等具有生理活性的次級代謝產物[9-11]。洛伐他汀是Monacolin K的閉環形式（內酯型），具有抑制膽固醇合成、保護腎臟、抗動脈粥樣硬化、預防癌癥等功能[12-17]，但部分紅曲霉在代謝產生多種具有生理活性的化合物的同時，也能產生對人體具有致癌致畸作用的腎毒性真菌毒素——桔霉素[18]，這極大地限制了紅曲以及紅曲發酵產品的開發和應用。因此，篩選出高產功效因子、低產桔霉素等毒性化合物的生產菌株，是生產高品質紅曲霉發酵產品的關鍵。

由于紅曲具有降血壓的功效，并帶有甘味及抑制雜菌的作用，加上紅曲的發酵作用，可將其用于含鹽或低鹽的發酵食品，為高血壓患者提供健康美食。如在紅腐乳發酵過程中，添加高產洛伐他汀的紅曲菌，增強腐乳降血壓保健功效。目前的研究主要集中于紅曲霉產洛伐他汀工藝條件的優化及誘變選育，鮮有高產洛伐他汀紅曲霉在腐乳中的應用。

本研究通過對紅曲菌株進行形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術，采用超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法分析紅曲菌株發酵液中桔霉素和洛伐他汀的含量，選育高產洛伐他汀低產桔霉素的紅曲霉優良功能菌株，并將其用于功能紅腐乳的制備，分析其產品感官、理化及微生物指標，以期為功能性紅腐乳的產業化生產提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紅曲菌株M1、M2：武漢佳成生物制品有限公司；紅曲菌株M3：北京王致和食品集團有限公司；紅曲菌株M4、M5：福建省古田縣生華紅曲有限公司；紅曲菌株M6、雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）：北京市食品釀造研究所。

1.1.2 試劑

洛伐他?。兌龋?9.5%）、桔霉素（純度＞99.5%）：中國食品藥品檢定所；甲醇（色譜純）：德國Merck公司；真菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMEGA公司；ExTaq酶：美國NEB公司；引物的合成由北京奧克鼎盛生物科技有限公司完成；大豆、食鹽、香辛料、白砂糖、食用酒精、某品牌紅腐乳：市售；面黃：北京二商王致和食品有限公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[19]：去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加1 L蒸餾水煮30 min，雙層紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖，蒸餾水補充至1 L，固體培養基中加入2%瓊脂，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

察氏瓊脂（Czapek-dox agar，CA）培養基[19]：葡萄糖30 g、NaNO33 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂20 g，蒸餾水補充至1 L，pH自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

麥芽汁瓊脂（malt extract agar，MEA）培養基[20]：10°Bx麥芽汁100 mL，瓊脂2 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

發酵培養基：14.4°Bx飴糖溶液100 mL，蛋白胨5 g，可溶性淀粉5 g，冰醋酸0.2 mL，pH 4.5～5.0，蒸餾水補充至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

1290 infinity II超高效液相色譜儀-6470串聯四級桿質譜：美國Agilent公司；5810/5810R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；BX53MRF-S顯微鏡：日本奧林巴斯公司；BT25S電子天平：Sartorius科學儀器（北京）有限公司；Milli-Q純水儀：美國Millipore公司；SW-CJ系列超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；CH-4103搖床：瑞士Infors生物技術有限公司；DHG-9051A電熱恒溫干燥箱、DHP-9051B微生物培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；T100梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅曲菌株的鑒定[21-22]

形態觀察：采用點種法將5株菌株（M1～M5）分別接種于PDA、MEA及CA培養基，于30 ℃條件下培養7 d進行觀察記錄。觀察菌落大小、正背面顏色、形狀、菌絲體形態等。采用粘片法對菌株的個體形態進行觀察。

生理生化試驗：以察氏培養基為基礎培養基，測定5株菌株對不同碳源（果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、山梨糖）及氮源（硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、亞硝酸鈉、牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白）的利用能力，并進行明膠水解試驗。

分子生物學鑒定：采用真菌基因組提取試劑盒提取5株菌株的DNA，以其為模板，采用18S rDNA通用引物對NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS8（5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'）對5株菌株的18S rDNA區基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系（50 μL）：10×Ex Buffer 5 μL、ExTaq酶0.5 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonu cleoside triphosphate，dNTP）8 μL、引物1 μL、模板1 μL，用無菌水補充至50 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠檢測合格后委托北京華大基因測序公司進行測序，測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的18S rDNA序列，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.2 高產洛伐他汀低產桔霉素紅曲霉菌株的篩選

將5株紅曲霉菌株分別接種于發酵培養基中，在30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養5 d，取30 mL發酵液，采用UPLCMS/MS測定洛伐他汀和桔霉素含量，試驗重復3次。

1.3.3 功能紅腐乳加工工藝流程及操作要點[23-24]

操作要點：

大豆、浸泡：挑選顆粒飽滿、碩大的黃豆，去除雜質，清洗浸泡，加入大豆質量3倍左右的水，室溫下浸泡18 h。

磨漿、煮漿：將浸泡好的大豆瀝凈水，加入浸泡大豆質量2.5倍左右的水，采用豆腐機磨漿，將豆漿抽入常壓煮漿罐中，通過蒸汽將豆漿加熱至95 ℃，保持3 min。

點腦、蹲腦：豆漿溫度在室溫下自然降至90 ℃時，邊攪動邊緩慢加入10%左右的氯化鎂溶液，待液體逐漸澄清時停止加入，添加量一般為大豆質量的2%，點腦的豆漿靜置20 min左右。

壓榨、切塊：將豆腐腦倒入壓榨機中壓榨，保證豆腐水分含量在70%左右，將豆腐切成2.0 cm×1.5 cm的豆腐塊，即為豆腐白坯。

接種雅致放射毛霉：將前期篩選的高產蛋白酶的雅致放射毛霉配制成107CFU/mL的菌懸液，待豆腐白坯溫度降至30 ℃左右，在豆腐白坯的六個面均勻接種。

毛坯：室溫發酵72 h。雅致放射毛霉發酵過程中，要隨時檢查菌絲的生長情況。

鹽坯：毛坯經搓毛之后，排碼平整，均勻撒鹽，從下往上碼一層坯子，撒一層鹽，鹽量逐漸加大，裝滿后撒上一層封頂鹽，腌制5 d左右。鹽量為1 000塊毛坯用鹽10～12 kg。

添加湯料：湯料主要包括紅曲（利用高產洛伐他汀低產桔霉素叢毛紅曲霉M2）、面黃、香辛料、白砂糖、酒精和水。將45 g紅曲米和285 g面黃與香辛料的混合物加入900 mL酒精（28%vol）后浸泡過夜，次日加入360 g白糖、360 mL水和300 mL酒精（45%vol）后研磨均勻即成紅方湯料。將湯料均勻撒入鹽坯，使每塊鹽坯的各面都沾上湯料。

裝瓶發酵：將沾有湯料的鹽坯立即裝入壇內，灌滿湯料，35～38 ℃條件下發酵70～90 d，成熟后即得成品功能性紅腐乳。

1.3.4 功能紅腐乳產品品質的測定

感官指標及理化指標（水分含量、氨基酸態氮、水溶性蛋白質、總酸和食鹽含量）：參照商業標準SB/T 10170—2007《腐乳》測定[25]；微生物指標（大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）：參照國家標準GB 29921—2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》測定[26]。

1.3.5 洛伐他汀及桔霉素含量的測定

采用UPLC-MS/MS法測定洛伐他汀和桔霉素含量。

標準溶液的制備：分別準確稱取洛伐他汀和桔霉素標準品各1.00 mg，用體積分數90%甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的標準溶液儲備液。

樣品前處理：取適量的紅腐乳塊樣品，淋干湯汁，均質并混合均勻。準確稱取0.1 g（精確至0.01 g）樣品，加入體積分數90%的甲醇定容至10 mL，搖勻后12 000 r/min離心5 min，取上清液。

UPLC條件：Eclipse Plus C18色譜柱（50 mm×3.0 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流速0.4 mL/min；流動相梯度洗脫程序：0～2 min，0.1%甲酸溶液80%；2～4 min，0.1%甲酸溶液20%；4 min之后0.1%甲酸溶液80%；進樣量1.0 μL。

MS條件：電噴霧離子（electron spray ionization，ESI）源，噴霧電壓3000V，輔助氣氣化溫度200℃，鞘氣流速11mL/min，鞘氣溫度325 ℃。多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）質譜參數見表1。

定性定量方法：配制質量濃度分別為1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、25.0 μg/mL、50 μg/mL的混合標準品溶液，在選定的儀器條件下進行測定，分別以洛伐他汀和桔霉素的質量濃度（X）為橫坐標，對應的峰面積（Y）為縱坐標，繪制洛伐他汀和桔霉素標準曲線，按照標準曲線回歸方程計算樣品中目標化合物質量濃度。

表1 目標化合物多反應監測質譜參數Table 1 Mass spectrum parameters of multiple reaction monitoring of target compounds

2 結果與分析

2.1 洛伐他汀及桔霉素的測定

洛伐他汀和桔霉素標準品溶液及菌株M2發酵液的UPLC-MS/MS色譜圖見圖1。由圖1可知，洛伐他汀和桔霉素標準品的出峰時間分別為1.622 min和2.334 min，發酵液中的洛伐他汀和桔霉素的出峰時間分別為1.619 min和2.351 min。結果表明，樣品與標準品洛伐他汀和桔霉素保留時間一致，標準品、樣品峰型良好。

圖1 洛伐他汀和桔霉素標準溶液（A）和菌株M2發酵液（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of lovastatin and citrinin standard solution (A)and fermentation liquid of strain M2 (B)

以洛伐他汀和桔霉素含量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制洛伐他汀和桔霉素標準曲線，得到洛伐他汀和桔霉素標準曲線回歸方程分別為Y=43.557 110X+42.910 902、Y=843.573 305X-17.908 294，相關系數分別為R2=0.999 0、R2=0.999 9，說明在0.1～50 ng/mL的質量濃度范圍內，峰面積與洛伐他汀和桔霉素含量之間的線性關系良好，可用于菌株發酵液中洛伐他汀及桔霉素產量的測定。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態觀察

將5株紅曲菌株（M1～M5）分別在PDA培養基、麥芽汁培養基及察氏培養基上培養7 d后，觀察菌落及細胞形態，其代表菌株M2的菌落形態見圖2，顯微形態見圖3。

圖2 不同培養基上菌株M2的菌落形態Fig.2 Colonial morphology of strain M2 on different media

由圖2可知，菌株M2在PDA培養基上生長最好，MEA培養基次之，CA培養基最差，且均在PDA培養基上菌絲呈絨狀，正面顏色由橙色到白色，背面顏色由葡萄醬紫色到橙色，褶皺不明顯，邊緣整齊，隆起并裂開；在MEA培養基上菌絲呈絨氈狀，正面顏色由橙色到白色，背面為葡萄醬紫色，有明顯褶皺，邊緣不整齊；在CA培養基上菌絲呈從卷毛狀，正面顏色由橘色到橙色，背面顏色由橘色到橙色，無明顯褶皺，邊緣不整齊。

圖3 菌株M2的顯微形態Fig.3 Microscopic morphology of strain M2

由圖3可知，菌株M2的菌絲具有細胞橫隔，分支甚繁，且不規律，分生孢子呈球形或梨形，著生在菌絲及其分支的頂端，單生或2～6個，呈鏈狀；閉囊殼呈球形，有柄，柄長短不一，閉囊殼內散生十多個子囊，子囊呈球形，含子囊孢子，成熟后子囊壁解體，孢子剩留在薄壁的閉囊殼內。

2.2.2 生理生化試驗

5株菌株的生理生化試驗結果見表2。

表2 5株菌株的生理生化試驗結果Table 2 Results of physiological and biochemical tests of 5 strains

由表2可知，5株菌株均可以很好地利用麥芽糖、葡萄糖，微弱利用果糖、蔗糖、乳糖，但不能利用山梨糖，可以很好地利用硝酸鈉、牛肉膏、酵母膏及大豆蛋白胨，但對其他無機氮源的利用能力較差。5株菌株均能使明膠液化。結合形態觀察，參照《紅曲菌的形態與分類學》[27]，發現該菌株各項特征與曲霉科（Aspergillaceae）紅曲霉屬（Monascussp.）的特征基本一致，初步鑒定5株菌株均為紅曲霉屬（Monascussp.）。

2.2.3 分子生物學鑒定

基于18S rDNA基因序列5株菌株的系統發育樹見圖4。由圖4可知，菌株M1、M3、M4、M5均與紫色紅曲霉（Monascus purpureus）strain ATCC 16358（AB477243.1）聚于一支，親緣關系最近；菌株M2與叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）strainCBS 286.34（KY635852.1）聚于一支，親緣關系最近。

圖4 基于18S rDNA基因序列5株菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 5 strains based on 18S rDNA gene sequences

結合形態觀察、生理生化試驗結果，最終鑒定菌株M1、M3、M4、M5均為紫色紅曲霉（Monascus purpureus），菌株M2為叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）。

2.3 高產洛伐他汀低產桔霉素紅曲霉菌株的篩選

采用UPLC-MS/MS法測定5株紅曲霉菌株發酵液中的洛伐他汀及桔霉素產量，結果見表3。

表3 5株紅曲霉菌株的洛伐他汀及桔霉素檢測結果Table 3 Determination results of lovastatin and citrinin of 5 strains of Monascus sp.

由表3可知，紅曲菌株M2發酵液中的洛伐他汀產量最高，為15.67 mg/L，紅曲菌株M1和M5洛伐他汀產量分別為0.31 mg/L、0.10 mg/L，紅曲菌株M3、M4發酵液中均未檢出洛伐他汀。5株紅曲霉菌株的培養液中均檢出桔霉素，含量在2.97～33.21 μg/L。因此，篩選出叢毛紅曲霉M2為高產洛伐他汀低產桔霉素的菌株。黑利生等[28]從紅曲米中篩選并鑒定得到一株洛伐他汀產量較高的紫色紅曲霉MPT13；唐旭等[29]通過發酵罐補料液體發酵紫色紅曲霉，洛伐他汀產量最高達79.83 mg/L；游玟娟等[30]對高產洛伐他汀突變株Monascussp.UV-D-9的發酵條件進行了響應曲面優化，在最優發酵條件下，洛伐他汀產量達到（0.32±0.014）mg/mL。

2.4 紅腐乳的品質分析

2.4.1 感官指標

將叢毛紅曲霉M2用于功能紅腐乳的制備，并以市售某品牌紅腐乳為對照，測定紅腐乳的感官指標并進行比較，結果見表4。

表4 兩種紅腐乳感官指標的測定結果Table 4 Determination results of sensory indexes of two kinds of red sufu

由表4可知，功能紅腐乳色澤棗紅、滋味鮮美、咸淡適宜、具有紅腐乳特有的氣味、質地細膩、塊形整齊、無外來可見雜質，其感官指標滿足商業標準SB/T 10170—2007《腐乳》[25]要求。

2.4.2 理化指標

以市售某品牌紅腐乳為對照，測定功能紅腐乳的理化指標并進行比較，結果見表5。

表5 兩種紅腐乳理化指標的測定結果Table 5 Determination results of physiochemical indexes of two kinds of red sufu

由表5可知，功能紅腐乳中水分、氨基酸態氮、水溶性蛋白質、總酸和食鹽含量分別為70.7%、0.74g/100g、7.10g/100g、0.91 g/100 g、8.17 g/100 g，理化指標均滿足商業標準SB/T 10170—2007《腐乳》的要求，且氨基酸態氮、水溶性蛋白質以及總酸含量均極顯著高于某品牌紅腐乳（P＜0.01）。

2.4.3 微生物指標

以市售某品牌紅腐乳為對照，測定功能紅腐乳的微生物指標并進行比較，結果見表6。

表6 兩種紅腐乳微生物指標的測定結果Table 6 Determination results of microbial indexes of two kinds of red sufu

由表6可知，兩種紅腐乳中大腸菌群和金黃色葡萄球菌群均＜10 CFU/g，致病菌沙門氏菌均未檢出。結果表明，功能紅腐乳微生物指標滿足GB/T 2712—2014《食品安全國家標準豆制品》[31]、GB 29921—2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》[26]要求。

2.5 功能紅腐乳中洛伐他汀和桔霉素含量的測定

采用UPLC-MS/MS對功能紅腐乳產品中洛伐他汀和桔霉素含量進行分析，并與某品牌紅腐乳進行比較，結果見圖5。

圖5 功能紅腐乳與某品牌紅腐乳洛伐他汀和桔霉素含量的比較Fig.5 Comparison of lovastatin and citrinin contents between functional red sufu and a red sufu

由圖5可知，功能紅腐乳中洛伐他汀含量為17.08 mg/kg，遠高于市售某品牌紅腐乳，功能紅腐乳中桔霉素含量為105.77 μg/kg，低于市售某品牌紅腐乳，說明功能紅腐乳具有良好的開發應用前景。

3 結論

通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定5株紅曲霉菌株中菌株M1、M3、M4、M5均為紫色紅曲霉（Monascus purpureus），菌株M2為叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）。其中，叢毛紅曲霉M2發酵液中洛伐他汀產量最高為15.67 mg/L，桔霉素產量為4.68 μg/L。將高產洛伐他汀低產桔霉素的菌株M2應用于功能紅腐乳的開發，其感官指標、理化指標及微生物指標均符合相關標準要求，與市售某品牌紅腐乳相比，其洛伐他汀含量（17.08 mg/kg）較高，桔霉素含量（105.77 μg/kg）較低，為功能紅腐乳的深入研究奠定了基礎。