櫻桃酒釀造用產香酵母的篩選及其特征香氣成分分析

彭 璐，明紅梅*，陶 敏，任 清，熊堂語，王 軒，俞 飛

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.北京工商大學 輕工科學技術學院，北京 100048）

櫻桃富含糖類、蛋白質、維生素及鈣、鐵、鉀等物質，具有較高的營養價值[1-2]。由于櫻桃易腐敗變質，不易儲存，需深加工利用[3]。開發櫻桃酒是提高櫻桃附加值是較為理想的選擇。櫻桃酒富含礦物質、維生素和多酚等保健成分[4-6]，具有良好的發展潛力。

果酒的風味與釀造酵母等微生物的特性密切相關，酵母是決定果酒品質優劣的重要因素之一。目前，果酒釀造大多采用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進行發酵，其發酵酒香氣淡薄，口感單一[7]。產香酵母能夠生成醇、醛、酯等多種芳香物質，對果酒風味有積極的影響[8]。劇檸等[9]利用產香酵母與商用釀酒酵母混菌發酵枸杞果酒，其酯類物質種類和含量均高于釀酒酵母單菌發酵酒，具有更加濃郁的花香、果香氣。袁曉龍等[10]利用一株產香酵母與釀酒酵母混菌發酵鴨梨酒，其總酯含量是釀酒酵母單菌發酵酒的2.6倍，并使酒體香氣更加濃郁和舒適。有研究者將產香異常畢赤酵母（Pichia anomala）與安琪酒酵母協同發酵生姜梨酒，結果表明，混菌發酵較安琪酵母單菌發酵增加了醇類、酯類和萜烯類香氣物質，賦予果酒優雅和諧的香味[11]。綜上，針對櫻桃酒釀造篩選優良產香酵母的報道較少，且開發果酒產香酵母也是目前果酒研發領域的熱點[12]。

本研究采集櫻桃、果園土壤樣本，經過三級篩選獲得適合櫻桃酒釀造的產香酵母，并探究其櫻桃汁發酵液的特征香氣成分，以期提高櫻桃酒品質，為果酒規模化、產業化發展奠定基礎，也為果酒專用酵母的開發提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

櫻桃、土壤：內江市慶衛鎮果園種植基地；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NJ1：實驗室保存優良菌種。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乳酸、乙酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博生物技術有限責任公司；2-辛醇（色譜純）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養基

富集培養基（酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基）：蛋白胨20 g，酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

分離培養基（孟加拉紅培養基）：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀0.25 g，尿素0.1 g，硫酸鎂0.5 g，1%孟加拉紅水溶液0.033 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

保藏培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

種子液培養基：櫻桃汁外觀糖度調整至10°Bx，pH值為4.5，煮沸5 min。

櫻桃酒發酵培養基：櫻桃汁外觀糖度調整至25°Bx，pH值為4.2，煮沸5 min。

櫻桃汁產香培養基（即櫻桃清汁）：櫻桃果汁含量為30%，外觀糖度為15°Bx，pH值為4.5，煮沸5 min。

1.2 儀器與設備

STO210 pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；LB20T手持折光儀：廣州市速為電子科技有限公司；50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭、手動固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）進樣器：美國Supelco公司；S-3400掃描電子顯微鏡：日本HITACHI公司；SKY-2102C恒溫搖床：韶關市廣智科技設備有限公司；Agligent 6890N-5975B氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌富集、分離與純化

櫻桃、土壤樣品中分別加入無菌水，搖勻后制成菌懸液。分別取10 mL菌懸液加入到90 mL YPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min條件下富集培養24 h。用無菌水將富集菌懸液梯度稀釋至10-3、10-4、10-5，并分別涂布于孟加拉紅培養基上，28 ℃條件下培養48 h。挑選符合《酵母菌的特征與鑒定手冊》[13]的酵母特征的單菌落，即菌落乳白或奶油色，表面球形凸起且光滑濕潤，并在YPD固體培養基劃線純化培養2～3次后，進行PDA培養基斜面保藏。

1.3.2 產香酵母菌的初篩

將保藏于PDA斜面的酵母菌接種于YPD培養基平板上，28 ℃培養3～5 d，通過嗅聞法[4]對酵母菌株進行香氣評價，初步篩選具有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株，用于后續菌種的復篩。

1.3.3 產香酵母菌的復篩

將初篩獲得的酵母菌接種于種子液培養基，28 ℃、150 r/min條件下培養至種子液濃度達到107個/mL，以8%（V/V）的接種量接種于櫻桃汁產香培養基中，28 ℃靜置微氧培養7 d，在發酵結束后測其總酯含量，并進行香氣評價[4]。

1.3.4 產香酵母菌的三級篩選

三級篩選是利用復篩酵母與釀酒酵母混菌發酵櫻桃酒的品質評價菌株的協同能力。參照文獻[2]利用復篩的產香酵母與釀酒酵母NJ1混菌發酵櫻桃酒，產香酵母和釀酒酵母NJ1分別接種于種子液培養基，28 ℃、150 r/min條件下培養至種子液濃度各達到107個/mL時，將產香酵母與釀酒酵母NJ1以1∶1的濃度比例同時接種到櫻桃酒發酵培養基，產香酵母與釀酒酵母NJ1總接種量按發酵液體積分數10%（各占5%）接種，29 ℃靜置培養10 d。當櫻桃酒還原糖質量濃度＜4 g/L（主發酵結束后），離心分離出酵母菌，終止乙醇發酵，用于后續試驗分析，測定其總酸、總酯含量、酒精度和揮發酸含量，并進行感官評價。

1.3.5 產香酵母菌的鑒定

將篩選獲得的目的酵母菌接種到YPD固體培養基上，28 ℃條件下培養2 d，觀察酵母菌的菌落形態；并且用掃描電子顯微鏡進行掃描，記錄并觀察酵母菌的細胞形態。同時將分離的酵母菌純種送至上海生工生物工程有限公司進行26S rDNA測序，將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA序列，采用MEGA6軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.6 目的酵母的特征香氣成分分析

將鑒定出的產香酵母菌株單菌落接種于櫻桃汁產香培養基，以櫻桃清汁（未接種的櫻桃汁）作對照組，29 ℃靜置培養10 d。發酵結束后利用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結合GC-MS技術，測定櫻桃汁發酵液和對照組中的揮發性成分[14]。半定量分析：以2-辛醇（終質量濃度259.99 μg/L）為內標物，通過半定量方法測定其含量。定性分析參文獻[11]。

1.3.7 理化指標測定

總酯含量參考曾智娟等[11]的方法，總酸含量、揮發酸含量、酒精度參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]；感官評價參考文獻[4]。

1.3.8 數據分析

利用Origin 2018、MEGA6等軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 產香酵母菌株的篩選

2.1.1 產香酵母菌株的分離及初篩結果

通過分離純化共獲得純種酵母菌35株。通過嗅聞法初篩后獲得5株具有較濃酯香氣或特殊果香氣酵母菌，編號分別為J2、J12、J13、J31和J33。

2.1.2 產香酵母菌株的復篩結果

將初篩優選的5株酵母菌分別接入櫻桃汁產香培養基進行單菌發酵，發酵結束后測定其總酯含量，并進行香氣評價，結果見表1。

表1 不同產香酵母菌株發酵液的總酯含量和香氣評價結果Table 1 Total esters content and aroma evaluation results of fermentation broth of different aroma-producing yeast strains

由表1可知，5株酵母菌發酵液的總酯含量差異不大，在3.03～3.10 g/L之間。其中菌株J2的總酯含量最高，菌株J12和J13的總酯含量較低。這可能是因為不同酵母分泌酯酶的種類及活性存在著差異，導致生成酯的能力也不相同[16]。結合香氣評價結果，初步優選酵母菌株J2、J31和J33做為下一步三級篩選菌株。

2.1.3 產香酵母菌株的三級篩選結果

分別將酵母菌株J2、J31、J33與釀酒酵母NJ1混菌發酵制備櫻桃酒，組合編號依次為A、B、C，對照組為釀酒酵母NJ1單菌發酵，編號為D。在主發酵結束后分別測定總酸、揮發酸含量、總酯含量、酒精度，并進行感官評價，結果見圖1。

圖1 各菌株組合發酵櫻桃果酒的理化指標Fig.1 Physicochemical indexes of cherry fruit wine fermented by different strains combination

由圖1可知，A、B、C、D組的酒精度差異均顯著（P＜0.05），可能是不同酵母與釀酒酵母協同發酵產酒精能力不同[11]。A組酒精度最高，達10%vol，與對照組（D組）比較，A組酒精度增加，這可能是A組中酵母（酵母J2）具有一定產酒精的能力[17]，有待進一步研究。A、B、C、D組的總酯含量差異均不顯著（P＞0.05），總酯含量在2.86～2.92 g/L之間，其中A、C組總酯含量較高，均為2.92 g/L；A、B、C組的總酯含量與D組比較均有所增加，說明A、B、C組中接入的產香酵母菌均具有較好的酯類物質合成能力。果酒中適當的酸含量有利于賦予果酒適口性，抑制雜菌，增加酒體穩定性[11]。A、B、C、D組的總酸含量差異均顯著（P＜0.05），這可能是不同的酵母菌株利用糖類物質代謝生成酸能力不同，部分酸類物質在發酵過程中作為中間代謝產物轉化為其他物質（酯類物質等）的能力不同[18]，A、B、C、D組的總酸含量均符合果酒行業標準《綠色食品果酒》要求（總酸含量應在4～9 g/L）[19]。揮發酸是酵母不完全發酵形成的副產物，適量的揮發酸賦予果酒愉悅的香氣[18]。A、B、D組的揮發酸含量與C組差異顯著（P＜0.05），這可能是不同的酵母產生揮發酸的能力不同。A、B、C、D組的揮發酸含量在0.29～0.37 g/L，均符合國標《葡萄酒、果酒通用分析方法》規定（揮發酸含量＜1.2 g/L）[15]。結合感官評價結果，A組果酒感官評分最高，達86分，酒體色澤深紅，果香、酒香濃郁，酸甜協調、口感柔和；B組果酒感官評分較低，為79分，酒體酸味突出，口感欠佳。綜上所述，A組即菌株J2與釀酒酵母NJ1發酵的櫻桃酒的協同效果最好，因此，確定菌株J2為優選的產香酵母。

2.2 產香酵母菌株J2的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

對菌株J2的菌落形態進行觀察，并將菌株J2于電鏡下觀察細胞形態，結果見圖2。

圖2 菌株J2的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of strain J2

由圖2可知，菌株J2在YPD固體培養基上的菌落整體呈圓形，顏色為乳白色，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，容易挑起，質地均勻，電子顯微鏡掃描出菌株J2的細胞形態為橢圓形，是酵母的典型細胞形態。故初步鑒定菌株J2為酵母屬菌株。

2.2.2 分子生物學鑒定

基于26S rDNA基因序列菌株J2的系統發育樹見圖3。由圖3可知，菌株J2與季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma caribbica）聚在同一分支，且相似度為100%，親緣關系最近，結合形態觀察，鑒定菌株J2為季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma caribbica）。

圖3 基于26S rDNA基因序列菌株J2的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain J2 based on 26S rDNA gene sequences

2.3 酵母J2的特征香氣成分分析

對菌株J2櫻桃汁發酵液的揮發性香氣成分進行分析，其GC-MS分析總離子流色譜圖見圖4，揮發性香氣成分檢測結果見表2。

圖4 菌株J2櫻桃汁發酵液揮發性香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile aroma components in cherry juice fermentation broth by strain J2 analysis by GC-MS

香氣是水果及果酒感官品質的重要組成部分[20]。由表2知，菌株J2櫻桃汁發酵液和櫻桃清汁中分別檢測出香氣成分42種和33種，總含量分別為9 555.63 μg/L和7 021.64 μg/L。有20種香氣成分僅在菌株J2櫻桃汁發酵液中檢測到，其總含量達443.64 μg/L。菌株J2櫻桃汁發酵液和櫻桃清汁中共有22種香氣成分，其中17種成分的含量顯著增加，其總含量相較櫻桃清汁增加了37.00%。

表2 菌株J2櫻桃汁發酵液揮發性香氣成分的GC-MS檢測結果Table 2 Detection results of volatile aroma components in cherry juice fermentation broth by strain J2 analysis by GC-MS

續表

2.3.1 酯類物質分析

菌株J2櫻桃汁發酵液中酯類物質總含量為6974.64 μg/L，比櫻桃清汁高1 193.77 μg/L。正己酸乙酯、乙酸糠酯、丙位癸內酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯只在菌株J2櫻桃汁發酵液中檢測到。正己酸乙酯閾值較低，是櫻桃酒主要香氣成分[5]。乙酸糠酯、丙位癸內酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯在櫻桃酒中較少報道，在其他果酒或白酒中有檢測出[21-22]。菌株J2櫻桃汁發酵液和櫻桃清汁共有成分含量差值較大的是乙酸乙酯、乙酸苯乙酯，其差值分別為870.25 μg/L和596.30 μg/L，這兩種酯類物質具有花果香氣，是櫻桃酒的主要香氣物質[23]。這些酯類的形成與酵母的酯酶轉化有關[24]。

2.3.2 醇類和醛酮類物質分析

菌株J2櫻桃汁發酵液中醇類物質總含量為631.52 μg/L，比櫻桃清汁高320.13 μg/L。正己醇、2-乙基己醇、糠醇、二聚丙三醇只在菌株J2櫻桃汁發酵液中檢測到。正己醇[25]、2-乙基己醇[25]、糠醇[26]是櫻桃酒的香氣成分。酵母經葡萄糖代謝途徑或氨基酸代謝途徑可生成醇類物質[27]。

菌株J2櫻桃汁發酵液中醛酮類物質總含量為271.14 μg/L，比櫻桃清汁高231.35 μg/L。2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、糠醛、5-羥甲基糠醛只在菌株J2櫻桃汁發酵液中檢測到，其中糠醛是櫻桃酒的特征香氣成分[25]。烴類物質經降解可產生醛酮類物質[28]。菌株J2櫻桃汁發酵液和櫻桃清汁共有成分含量差值較大的是3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇，其差值分別為128.30 μg/L和241.96 μg/L。2,3-丁二醇和3-羥基-2-丁酮是櫻桃酒重要香氣成分[29-30]，其在白酒中也有檢測到[31]。在酵母代謝過程中，3-羥基-2-丁酮與2,3-丁二醇這兩種物質存在相互轉化[32]。

2.3.3 酸類物質分析

菌株J2櫻桃汁發酵液中酸類物質總含量為1189.29μg/L，比櫻桃清汁高627.79 μg/L。異戊酸、丙基丙二酸只在菌株J2櫻桃發酵液中檢測到。菌株J2櫻桃汁發酵液和櫻桃清汁共有成分含量差值較大的是乙酸、辛酸，其差值分別為455.74 μg/L和171.77 μg/L。這些酸類物質是櫻桃酒香氣的來源[25，33]。酸類物質主要是高級脂肪酸分解或醇、醛氧化的產物，果酒中的乙酸、辛酸等有機酸，一方面來源于果實，另一方面可由酵母代謝產生[14]。

2.3.4 萜烯類物質分析

菌株J2櫻桃汁發酵液中萜烯類物質總含量為39.61μg/L，比櫻桃清汁高26.43 μg/L。其中α-萜品烯、異香葉醇、法呢醇只在菌株J2櫻桃汁發酵液中檢測到。這些萜烯類物質含量較低，閾值也較小，對果酒香氣有重要作用[34]，但在櫻桃酒中較少報道。萜烯醇經酵母的葡萄糖苷酶作用，可由果汁中的糖苷類物質水解生成[35]。

2.3.5 芳香類物質分析

菌株J2櫻桃汁發酵液中芳香類物質總含量為449.44 μg/L，比櫻桃清汁高134.54 μg/L。苯乙醛、萘、4-乙基-2-甲氧基苯酚只在菌株J2櫻桃汁發酵液中檢測到。4-乙基-2-甲氧基苯酚是櫻桃酒的香氣成分[30]。菌株J2櫻桃汁發酵液和櫻桃清汁共有成分苯乙醇的含量差值較大，其差值達到60.64 μg/L。苯乙醇具有令人愉悅的玫瑰風味，是櫻桃酒香氣的骨架[33]。經研究發現，苯乙醇在酵母相關酶的作用下，經莽草酸或艾氏途徑生成[36]。

菌株J2櫻桃汁發酵液中共檢測到11種揮發性物質與文獻報道的櫻桃酒的特征香氣成分相一致[25，29-30]，包括正己酸乙酯、正己醇、2-乙基己醇、糠醛、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇、乙酸、辛酸、苯乙醇。

3 結論

從櫻桃及果園土壤樣本中經嗅聞香氣初篩、果汁發酵法復篩和混菌發酵櫻桃酒三級篩選，初步獲得一株可發酵產生果香、酯香香氣的酵母菌，編號為J2，經鑒定其為季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma caribbica）。菌株J2櫻桃汁發酵液中共檢測出42種香氣成分，其中，有20種香氣成分在櫻桃清汁中未檢測到，其總含量達443.64 μg/L；與櫻桃清汁中共檢測出22種相同的香氣成分，其中17種香氣成分含量顯著增加，其總含量相較櫻桃清汁增加了37.00%。這些香氣成分主要來源于櫻桃果實或者經酵母發酵產生。菌株J2櫻桃果汁發酵液中共檢測到11種揮發性物質與文獻報道的櫻桃酒的特征香氣成分相一致，包括正己酸乙酯、正己醇、2-乙基己醇、糠醛、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇、乙酸、辛酸、苯乙醇。因此，菌株J2為一株具有產香能力的酵母，可應用于櫻桃酒的釀造，有利于果酒的風味及品質的提升，在保持櫻桃酒典型性的同時，給酒體帶來獨特的香氣成分，增加香氣的豐富度。今后將進一步探索這些重要香氣成分的產生機制及其對櫻桃酒品質的影響，也可進一步拓展應用于其他發酵產品領域。