賈湖原香型白酒高溫堆積過程原核微生物的消長規(guī)律研究

王光路，張 帆，楊 旭，胡曉龍，王永亮，張治剛，劉智勇，李寶珍，楊雪鵬，馬歌麗

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；2.賈湖酒業(yè)集團有限責(zé)任公司，河南 舞陽 462400）

作為世界著名的六大蒸餾酒之一的中國白酒，在其不斷的發(fā)展壯大過程中，根據(jù)釀造工藝及風(fēng)格的差異，白酒共分為清香型、濃香型、醬香型和米香型這4個基本香型[1]。賈湖原香型白酒是賈湖酒業(yè)集團有限責(zé)任公司在濃香型白酒與醬香型白酒的釀酒工藝基礎(chǔ)上進行改良，獨自研發(fā)出的新型香型，具有“口感綿柔，醇香四溢”等風(fēng)格特點，現(xiàn)已投放市場并已大批量生產(chǎn)。高溫堆積發(fā)酵是賈湖原香型白酒生產(chǎn)過程中的一個重要環(huán)節(jié)，又稱“二次制曲”，堆積發(fā)酵可匯聚空氣中的微生物[2]，促進酒醅中的淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)進行分解轉(zhuǎn)化，改善原酒的風(fēng)格及提高酒體的豐滿度[3]，還為美拉德反應(yīng)提供反應(yīng)條件及前體物質(zhì)[4-5]。賈湖原香型白酒是利用高溫堆積工藝中發(fā)生的美拉德反應(yīng)結(jié)合多糧濃香型的泥窖固態(tài)發(fā)酵[6]，可以較好地改良原酒酒體的風(fēng)味與品質(zhì)，并且能夠豐富原酒的香味物質(zhì)成分。高溫堆積發(fā)酵是賈湖原香型白酒生產(chǎn)過程中至關(guān)重要的生產(chǎn)過程，為形成賈湖原香型白酒的酒體風(fēng)格提供香味成分或者積累香味前體物質(zhì)[7]。因此，對賈湖原香型白酒高溫堆積過程中的原核微生物群落結(jié)構(gòu)及其演替規(guī)律進行研究，有利于充分解析賈湖原香型白酒發(fā)酵機理，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

近幾年，國內(nèi)在釀酒領(lǐng)域方面的報道日益增多，高通量測序技術(shù)用于研究各種香型白酒釀造的微生物中[8-11]。對于醬香型和芝麻香型白酒的研究，主要集中在酒醅或大曲發(fā)酵過程，而較少研究賈湖原香型白酒酒醅堆積過程中的微生物結(jié)構(gòu)[6，12-13]。隨著高通量測序技術(shù)[14-17]的快速發(fā)展，其對白酒堆積過程的研究也日益增多。黃曉寧等[18]為探究同一酒廠濃香型和醬香型大曲微生物群落組成，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳法（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）對其微生物進行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)細菌組成均是以地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）占絕對優(yōu)勢，真菌組成在兩種大曲中差異較大。山其木格等[19]采用PCR-DGGE技術(shù)對醬香型糟醅堆積過程中的微生物種群變化規(guī)律進行研究，得出了糟醅堆積發(fā)酵過程中細菌種類多于真菌種類的結(jié)論。李小東等[20]通過在實驗室小規(guī)模模擬芝麻香型白酒堆積發(fā)酵及入窖發(fā)酵過程，研究不同堆積發(fā)酵條件對入窖發(fā)酵過程微生物菌群的演替規(guī)律及原酒品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)堆積溫度的高低對酒質(zhì)的影響較大。該研究對賈湖原香型白酒高溫堆積過程原核微生物的消長規(guī)律進行研究，旨在為原香型白酒的生產(chǎn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

賈湖原香型白酒酒醅樣品：來自賈湖酒業(yè)集團有限責(zé)任公司賈湖原香型白酒生產(chǎn)車間，由于自然堆積發(fā)酵受環(huán)境因素影響較大，每堆堆積為圓形，冬高夏矮，堆積時間需結(jié)合季節(jié)、氣候、收堆溫度和發(fā)酵程度來確定。

取樣過程采用了采樣堆平行取樣，步驟如下：采樣時間為0 h（堆積開始）（A0）、6 h（A6）、12 h（A12）、18 h（A18）、24 h（A24）、31 h（A31）、37 h（A37）及43 h（A43）（堆積結(jié)束），取樣時糟堆中的定點測定溫度分別為25 ℃、25.6 ℃、26 ℃、26.2 ℃、29.2 ℃、32.3 ℃、36.0 ℃和49.0 ℃。每個時間點的樣品為糟堆四個面及堆心的混合樣（500 g），采用取樣袋取樣，四個面取樣深度離糟堆表面10～15 cm處，堆心離糟堆表面約2 m處，混合樣品。每組樣品一式三份，一份用于微生物培養(yǎng)，兩份用于高通量測序，總計24個樣品。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母提取物：英國OXOID公司；瓊脂：北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、硫酸：重慶市川江化學(xué)試劑廠；氯化鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇、氫氧化鈉、五水硫酸銅：天津市鼎盛鑫化工有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、磷酸、重鉻酸鉀、碘化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、無水葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250：上海金穗生物科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：南京迪恩賽爾生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶、TaqPCR Master Mix、無菌去離子水：BBI生命科學(xué)有限公司；細菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：上海生工生物工程有限公司。所有試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

YP20001電子天平、CP214分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；PX2型PCR儀：德國Veriti公司；UV-1800型紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；MWS24型數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京市科菲發(fā)展儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；EF2型Syngene G：BOX凝膠成像系統(tǒng)：上海啟步生物技術(shù)有限公司；GR85DA型蒸汽滅菌鍋：濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；SHP-25型恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；Qubit?3.0熒光計：美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)微生物細菌的培養(yǎng)

把用于微生物培養(yǎng)實驗的8個樣品，無菌狀態(tài)下各稱取1.00 g，放入裝有99 mL無菌水的錐形瓶中，37 ℃恒溫搖床振蕩30 min，每個賈湖原香型白酒酒醅樣品做3個平行樣，樣品搖勻后靜置1 h后吸取1 mL稀釋液加入裝有9 mL無菌水的試管中，依次稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，在每個試管中吸取100 μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)1～2 d。

1.3.2 主要細菌的形態(tài)鑒定及16S rDNA序列分析

在LB固體培養(yǎng)基上觀察細菌的生長形態(tài)以及菌落大小，挑選出具有典型不同形態(tài)和大小的菌落，觀察其形態(tài)差異。根據(jù)細菌DNA提取試劑盒說明書，提取各個細菌的DNA，對提取的細菌基因組進行PCR擴增，擴增方法參照文獻[22]進行。采用細菌16S rDNA通用PCR引物27F（5'-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGT-TACCTTGTTACGACTT-3'）進行擴增，在25.0 μL PCR體系中，上、下游引物1492R和27F各1.0 μL，TaqMaster Mix 12.5 μL，細菌DNA 0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）10.0 μL。PCR擴增條件為初始變性94 ℃、15 min，然后變性94 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，復(fù)性72 ℃、90 s，30個循環(huán)，最后延伸72 ℃、10 min，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×Loading buffer于1%瓊脂糖凝膠120 V電泳25～30 min。反應(yīng)結(jié)束后，進行電泳，觀察到目的條帶則送去測序。

測序由上海生工生物工程有限公司完成，測序結(jié)果輸入美國國家生物信息技術(shù)中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建目標(biāo)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 高通量測序

酒醅樣品的DNA提取采用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒，具體實驗步驟參見說明書。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計檢測提取后的DNA純度和濃度。

采用細菌16S rDNA V3-V4區(qū)的PCR引物對提取的細菌基因組進行PCR擴增，PCR擴增體系及條件參照文獻[12]的方法進行，后續(xù)測序文庫構(gòu)建及Illumina MiSeq雙端測序均委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

使用測序的雙端序列數(shù)據(jù)構(gòu)建MiSeq文庫，對測得的數(shù)據(jù)過濾處理，除去Read尾部質(zhì)量值＜20 bp的堿基。設(shè)置50 bp窗口，若平均質(zhì)量值＜20，則從窗口開始截掉后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads；根據(jù)PE測序的Overlap關(guān)系，將成對的序列拼接（merge）為一條序列。根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），通常在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。將獲得的每個OUT的代表序列與核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）在線數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果，并對比對結(jié)果進行過濾，默認滿足相似度＞90%且覆蓋率＞90%的序列被用來后續(xù)分類，確定每個OTU的分類水平。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

參照文獻[12]的方法，水分直接用干燥法測定，淀粉用酸水解法測定，酸度用氫氧化鈉滴定法測定；根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍G-250染色法測定，粗乙醇用重鉻酸鉀-分光光度法測定，總?cè)┯脕喠蛩釟溻c-碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定法測定，酸度用氫氧化鈉滴定法測定，總酯用酸堿中和-皂化反滴定法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

利用Illumina MiSeq平臺進行測序分析，16個賈湖原香型白酒酒醅樣本原核微生物16S rDNA測序共產(chǎn)生83個OTU，其中檢測出6個門9個綱25個目35個科46個屬。

2.2 原核微生物群落多樣性與群落組成

2.2.1 門水平上的原核微生物多樣性

圖1 堆積發(fā)酵過程中門水平優(yōu)勢原核微生物菌群Fig.1 Dominant prokaryotic microbial communities of the samples at the phylum level during the stacking fermentation process

由圖1可知，經(jīng)高通量測序，結(jié)果顯示賈湖原香型白酒酒醅樣品中的原核微生物種群共6個門。其中有2個門的平均相對豐度大于1%，分別是厚壁菌門（Firmicutes，13.2%～90.7%）和變形菌門（Proteobacteria，3.0%～57.2%），其相對豐度占全部細菌群落的85.9%，其優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）。擬桿菌門（Bacteroidetes，0.01%～1.6%）、放線菌門（Actinobacteria，0.02%～1.9%）和藍藻菌門（Cyanobacteria，0～0.04%）的相對豐度占所有序列的0.9%。由圖1可知，F(xiàn)irmicutes含量呈先上升隨后下降的趨勢，從0 h的68.9%（各層含量平均值）明顯或顯著上升至6 h的83.82%，12 d后升至90.75%，隨后12～37 h含量下降至13.2%；而Proteobacteria呈下降趨勢，由0 h的10.01%，逐漸下降為6 h的3.86%，12 h時降至最低（3.14%），隨后上升至57.22%，表明酒醅堆積前期Firmicutes呈急劇上升趨勢且成為發(fā)酵的唯一優(yōu)勢菌門，而其他優(yōu)勢菌門逐漸下降（6～12 h），堆積后期厚壁菌門的含量下降而變形菌門類的微生物大量增加。

2.2.2 屬水平上的原核微生物多樣性

圖2 堆積發(fā)酵過程中屬水平優(yōu)勢原核微生物菌群Fig.2 Dominant prokaryotic microbial communities of the samples at the genera level during the stacking fermentation process

將每個樣品中含量≥1%的屬定義為優(yōu)勢屬，由圖2可知，優(yōu)勢菌種主要為枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）。隨堆積時間的增加，在0～12 h、37～43 h枝芽孢桿菌屬含量升高，醋酸桿菌屬含量下降。在12～37 h枝芽孢桿菌屬含量從83.87%下降至11.5%，醋菌屬含量從0.93%升高至53.62%。在堆積12 h前后，微生物的群落結(jié)構(gòu)變化比較明顯，如枝芽孢桿菌屬比例呈先增加后減少趨勢，醋酸桿菌屬比例顯著先減少后增加。枝芽孢桿菌屬可抑制有害菌及病原菌等有害微生物的繁殖進一步篩選出對發(fā)酵的有益菌群，還具有較強分泌蛋白酶及其他酶的能力，分解大分子物質(zhì)形成風(fēng)味物質(zhì)，增加白酒的風(fēng)味[13，23]。明晰酒醅中微生物群落的演替性及空間異質(zhì)性能為白酒風(fēng)味物質(zhì)溯源及揭示其形成規(guī)律提供較強的理論指導(dǎo)。以醋酸桿菌屬為例，其在比較高的溫度下（40 ℃）可以發(fā)育，代謝產(chǎn)酸使酒醅中的酸度增大，說明隨著堆積的不斷進行，醋酸桿菌屬為耐酸類優(yōu)勢菌屬，對后期蒸餾酒起到了重要的作用，但是過多酸性物質(zhì)的積累對蒸餾酒的品質(zhì)會產(chǎn)生損壞。

2.3 理化性質(zhì)分析

對采集的賈湖原香型白酒酒醅樣品進行了理化性質(zhì)分析，其水分、蛋白質(zhì)、淀粉含量的測定結(jié)果見圖3。由圖3可知，樣品溫度在前24 h保持在30 ℃以下，后24 h呈曲線上升，在43 h基本達到50 ℃左右，堆積過程中溫度整體呈逐漸上升的趨勢。水分含量由開始的48.85%到結(jié)束時下降至45%，整體下降3.9%。水分含量逐漸下降，這是由于在高溫堆積過程中，微生物繁殖代謝產(chǎn)生的生物熱導(dǎo)致糟堆水分有所揮發(fā)，同時淀粉含量也由開始的22.63%一直到36 h下降至17.78%左右，整體下降4.85%，總體也呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于堆積初期酒醅營養(yǎng)豐富，微生物在高溫堆積過程中生長、繁殖和代謝活動均多利用大分子物質(zhì)淀粉作為主要碳源，代謝比較旺盛，淀粉分解速度較快。而高溫堆積酒醅中蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出較快上升趨勢，蛋白質(zhì)含量由5.4%升高至7.8%，上升了2.4%。這是因為在堆積過程中，微生物生長時間較短以及蛋白酶含量不多，分解蛋白質(zhì)能力較弱，可以推測賈湖原香型白酒高溫堆積初始階段微生物的代謝活動對氮源需求量不大，蛋白質(zhì)相對含量的上升很可能與碳源消耗以及水分揮發(fā)等條件有關(guān)。

圖3 水、蛋白質(zhì)及淀粉含量隨堆積時間的變化Fig.3 Change of water,protein and starch contents with stacking time

總?cè)⒖偹帷⒖傰ルS堆積時間的變化見圖4。由圖4可知，總?cè)┖孔罱K保持在0.53%左右，平均上升0.08%，變化幅度較小。由于醛類具有毒性，而樣品總?cè)┖康驼f明高溫堆積過程中的酒醅新鮮，醛類物質(zhì)含量較少，對微生物生長抑制作用小。總酸度始終保持在0.87%～1.10%之間，整體趨向穩(wěn)定。酸度的大小可揭示酒醅中產(chǎn)酸微生物數(shù)量的多寡，結(jié)果說明賈湖原香型酒醅高溫堆積過程中始終處于酸性狀態(tài)，較為穩(wěn)定。高溫堆積過程中總酸度的升降趨勢，側(cè)面反映了微生物的消長及酒醅基質(zhì)的狀態(tài)，有利于改良酒醅的原料條件[24]。總酯的含量最終保持在6.15%左右，說明在賈湖原香型白酒高溫堆積中，總酯含量趨向平穩(wěn)，并未呈現(xiàn)大幅變化趨勢。以上結(jié)果說明高溫堆積過程主要是以環(huán)境微生物的大量富集為主，為后續(xù)的窖池發(fā)酵過程提供重要的微生物來源。

圖4 總?cè)⒖偹峒翱傰ズ侩S堆積時間的變化Fig.4 Change of total aldehyde,total acid and total ester contents with stacking time

理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，在賈湖原香型白酒酒醅高溫堆積以及進一步的窖池發(fā)酵中，細菌起到了主要作用[25-26]。堆積發(fā)酵可以匯集環(huán)境中的微生物，而溫度偏高使微生物進一步自然篩選，在堆積結(jié)束時，優(yōu)勢微生物菌群演替完成，為入窖發(fā)酵提供良好的微生物基礎(chǔ)[27]。大量乳酸積累降低白酒的品質(zhì)，明晰酒醅中與降乳酸相關(guān)的微生物菌群的多樣性，將有助于從賈湖原香型白酒生產(chǎn)源頭上解決“增己降乳”的問題[28-29]。

2.4 分離細菌的形態(tài)鑒定及16S rDNA序列分析

2.4.1 分離細菌的形態(tài)鑒定

在LB固體培養(yǎng)基上觀察細菌的生長形態(tài)以及菌落大小，從而挑選出具有典型不同形態(tài)和大小的菌落，并進一步推測堆積酒醅中不同時段含有的菌種。初步挑選了6個菌落進行形態(tài)觀察，結(jié)果見圖5。由圖5可知，菌株A18-1菌落呈白色，不定形，較小褶皺，表面不光滑突起，邊緣相對不整齊，干燥，菌落較小。菌株A18-2菌落呈乳白色，不定形，有褶皺，突起，邊緣不整齊，挑取時十分粘稠，菌落較大。菌株A18-5菌落呈乳白色，不定形，無褶皺，表面光滑突起，邊緣整齊，菌落較小。菌株A24-10菌落呈白色，不定形，有褶皺，表面不光滑突起，邊緣不整齊，呈蔓延式生長，菌落較大。菌株A31-14菌落呈淡白色，不定形，無褶皺，表面光滑，邊緣不整齊，菌落較大，干燥。菌株A31-16菌落呈白色，不定形，較小褶皺，表面不光滑，邊緣相對不整齊，干燥，菌落較大。

圖5 6株菌株的菌落形態(tài)Fig.5 Colony morphology of 6 strains

2.4.2 分離細菌的分子生物學(xué)鑒定

進一步利用分子生物學(xué)手段鑒定分離出來的細菌。采用通用引物27F和1492R，PCR擴增獲得細菌16S rRNA序列，并進行序列測定。將測得的核苷酸序列通過NCBI-BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取結(jié)果中同源性高的序列。采用MEGA-X軟件進行序列比對，NJ法多序列連配分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。以菌株A24-10為例，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6。由圖6可知，菌株A18-1、A18-5和A37-16均為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）；菌株A18-2為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）；菌株A31-14為線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）；菌株A24-10為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。分離菌株為后續(xù)的產(chǎn)香微生物的分離和篩選提供了研究基礎(chǔ)。

圖6 基于16S rDNA基因序列菌株A24-10的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain A24-10 based on 16S rDNA gene sequences

3 結(jié)論

本研究基于高通量測序技術(shù)分析了賈湖酒業(yè)集團有限責(zé)任公司酒醅堆積過程中原核微生物菌群演替規(guī)律，結(jié)果表明，賈湖原香型白酒高溫堆積工序酒醅的原核微生物中共檢測出1個界6個門9個綱25個目35個科46個屬。檢出了其優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes，13.2%～90.7%）和變形菌門（Proteobacteria，3.0%～57.2%），它們的相對豐度占所有序列的85.9%，枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和醋酸菌桿屬（Acetobacter）為優(yōu)勢菌屬。另一方面，從理化性質(zhì)分析結(jié)果可看出，在賈湖原香型白酒酒醅高溫堆積以及進一步的窖池發(fā)酵中，細菌起到了主要作用，提供了良好的微生物優(yōu)勢菌群，提高白酒的風(fēng)味。此外，本研究僅從DNA水平揭示了不具有活性的微生物菌群結(jié)構(gòu)差異，后續(xù)需要進一步結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué)等方法深入分析不同微生物結(jié)構(gòu)差異。