葡萄酒中生物性來源有害產物的研究進展

張 雪，谷曉博，王克清，金 剛，張軍翔，劉敦華，馬 雯

（1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021；3.葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心，寧夏 銀川 750021；4.寧夏葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021）

葡萄酒是新鮮葡萄或葡萄汁在微生物作用下，經歷復雜的生物化學變化形成的具有獨特風味的酒精飲品。近年來，隨著葡萄酒文化的普及和消費市場的擴大，葡萄酒受到越來越多消費者的青睞。同時，伴隨著科技的發展和人們健康意識的增強，葡萄酒的質量安全問題也越來越受到重視，特別是一些生物性來源危害物質備受關注。葡萄酒的生產主要包括微生物的發酵和儲藏兩個過程，這些過程條件控制不當，葡萄酒容易產生有毒有害物質。此外，加工過程操作不規范和衛生條件差等原因會造成外來微生物的污染。

葡萄酒中的生物性來源有害產物主要是由一些微生物代謝產生的對葡萄酒飲用質量和食品安全造成影響的一些物質，長期過量攝入這些物質可能會引發一系列疾病，如葡萄酒發酵過程中一些微生物可通過尿素循環途徑產生氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）[1-2]、黑曲霉（Aspergillus niger）等真菌污染會產生赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）[3]、氨基酸脫羧會產生生物胺（biogenic amine，BAs）[4]，這些物質長期過量累積可能會誘發癌癥等疾??；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）污染產生腸毒素等多種毒素可能會引發一系列急性中毒[5]；一些真菌產生的2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trinitroanisole，TCA）會嚴重敗壞葡萄酒的品質[6]。

為了預防和減少葡萄酒中有害物質的產生和污染，葡萄酒生產和消費量多的國家早在20世紀80年代開始就陸續制定了相應的限量標準[7]，如氨基甲酸乙酯在1943年被證實為一種致癌物質，國際癌癥研究所將其歸為“2B”類致癌物，先后在蒸餾酒、白蘭地等多種發酵飲料和食品中被發現。1985年加拿大政府首次規定了氨基甲酸乙酯在佐餐葡萄酒中的限量（30 μg/L），隨后，美國于1988年規定了佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯的非強制限量（15 μg/L），歐盟的一些成員國和韓國也做出了相應的限量規定，由表1可以清楚的看到世界上幾個知名葡萄酒產國對幾種生物行來源有害產物的限量標準。2007年氨基甲酸乙酯被國際癌癥機構重新歸為“2A”類致癌物，但到目前為止，我國仍未有相應的限量標準。并且由于我國的葡萄酒產業起步相對較晚，生產條件較差，相關的技術人員短缺，普通工作人員生產過程中食品安全控制意識不強，檢測條件也相對落后，加上經營者利益至上的生產方式，使得葡萄酒的質量安全狀況不容樂觀。

表1 葡萄酒中生物性來源有害物質限量Table 1 Limits of hazards of biological origin in wine

基于此，本文主要介紹了氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A、金黃色葡萄球菌、生物胺和2,4,6-三氯苯甲醚5種葡萄酒中可能存在（或超標）的生物性來源有害產物，從其來源、危害、影響因素、限量、檢測方法及防控措施幾方面進行概述，以期為葡萄酒質量安全的檢測和防控提供較為系統、全面的參考。

1 氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（EC）別稱尿烷、烏拉坦等。廣泛存在于酒精飲料、酸奶和面包等發酵食品中[1]。近年來，隨著人們對EC認識的深入，發現EC對人類健康存在潛在的威脅，并被世界衛生組織列為人類可能的“2A”類致癌物，具有遺傳毒性和多位點致癌性，可導致動物患肺癌、肝癌和血管癌等[7]。EC的致癌性與代謝形成EC后的環氧化有關，環氧化可導致包括肺、肝和乳腺等多個器官內脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的內收和突變[13]。葡萄酒等酒精飲料是攝入EC的主要來源，且乙醇具有促進EC致癌的作用[14]。聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織專家建議，應盡量降低發酵飲料中EC的含量以保障人類健康。

1.1 EC的來源及影響因素

葡萄酒中的EC主要由酵母和乳酸菌發酵過程中的精氨酸代謝產生，參與EC形成的前體物質有尿素、瓜氨酸、氨基甲酰磷酸、氰酸和焦碳酸二乙酯[2]。EC形成的兩條主要途徑分別為乙醇與尿素和瓜氨酸的反應，其中尿素循環途徑是最主要的[1]。

EC的含量與原料品質和工藝有關，原料品質及工藝會影響前體物質的含量，從而影響EC的含量。EC的含量會隨發酵過程前體物質的消耗[1]和陳釀時間延長而增加[15]；此外，生物學條件、葡萄品種、陳釀容器等都會影響葡萄酒中EC濃度的變化[15]。

1.2 EC的檢測及防控方法

目前，應用于葡萄酒中EC檢測的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和氣相色譜（gas chromatography，GC）法[14]。其中，GC是目前定量EC最權威的方法，可以進行痕量水平的檢測[2]。TU Q Q等[16]選用了一種新的輔助提取劑，采用多維氣相色譜-質譜聯用，測定葡萄酒中的EC，并對進樣量、氯化鈉、酸濃度等影響提取效率的因素進行了優化驗證，該方法具有良好線性（R2=0.999 8）、靈敏度、精密度和準確度，且檢出限（limit of detection，LOD）0.02 μg/L和定量限（limit of quantitation，LOQ）0.10 μg/L均低于之前的文獻報道。除了不斷改進的HPLC和GC技術，紅外光譜[17]和電化學傳感器[14]等用于EC分析檢測的技術也在不斷得到改進。旨在為葡萄酒及其他食品中EC的檢測提供更加準確、高效的方法。

在葡萄酒生產過程中，控制EC含量的方法可分為物理、化學方法及酶學和代謝工程技術。酶學和代謝工程技術近年來很受歡迎，它們不改變菌株和工藝條件即可有效降低EC，并保持原有的風味，如利用尿素酶降解EC或降解尿素來減少前體物的含量來控制EC的含量[18]，利用微生物基因相關轉錄因子調控降低尿素和EC的代謝[19]。此外，還可以通過木炭、樹脂吸附過濾葡萄原料；避免過量施用氮肥，選擇產生精氨酸水平較低的優良葡萄品種；進行工藝優化，控制好發酵和儲存過程中的溫度、pH值和乙醇含量等[2]物理方法；通過添加氰化物、銅等催化劑等化學方法降低EC及前體的含量。

2 赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素A（OTA）是最常見的霉菌毒素之一，是由不同的曲霉、青霉屬絲狀真菌產生的次生代謝產物。具有腎毒性、致癌性和肝毒性等，同時具有較高的熱穩定性和化學穩定性，不易降解[3]，攝入過量會對人類和動物的健康構成嚴重的威脅。

2.1 OTA的來源及影響因素

OTA最初是在葡萄酒和葡萄汁中發現的，廣泛存在于自然界中[20]。多項研究表明，黑曲霉科是葡萄中OTA污染的主要來源[3]。OTA的產生受水分活度、溫度和葡萄品種等因素的影響（OTA的產生需要適宜的溫度和濕度，不同的葡萄品種對真菌侵染也有不同的抗性），葡萄成熟期間高溫、高濕和降雨都會加重OTA污染[3]。還有研究發現，隨著葡萄成熟過程pH值、總糖、總可溶性固形物和總花青素的升高，OTA及其衍生物的含量也逐漸升高，所以，成熟階段的葡萄更容易產生OTA[21]。

2.2 OTA的檢測及防控方法

薄層色譜法、HPLC和GC法是OTA的常規分析檢測方法，此外，還有傳感器法、酶聯免疫吸附法等免疫化學法[22]。免疫化學法是一種比較經濟、高通量的方法，但其應用受抗體制備和穩定性等因素的限制。為了克服這些缺點，出現了很多新型傳感器。YIN X T等[20]以金納米粒子為探針，36聚體適配體為識別元件，利用OTA和金納米粒子特異性識別來實現OTA的定量，線性范圍為32～1 024 ng/mL，檢出限為20 ng/L，該比色生物分析法相比其他抗體法具有更好的選擇性。WU K F等[23]研發了一種適配體熒光生物傳感器，由核糖核酸酶H輔助的循環反應組成，將信號顯著放大，檢測限可達0.08 ng/mL，回收率在96.1%～107.5%之間，具有高選擇性，可以通過替換識別適配體序列擴展到其他毒素檢測。

葡萄酒中OTA的污染，一般在葡萄生長期間產生，也可能源于后期污染，減少葡萄酒中OTA可以分前期預防和后期去除兩部分。自然條件是不可控的，前期預防主要通過保護葡萄免受機械和蟲害損傷、剔除受損葡萄；減少與雜草和不衛生的材料等接觸；利用拮抗微生物與具有抑菌性的天然抗氧化劑（如香草醛）或低劑量殺菌劑聯用進行生物防治來控制植物病原菌等[24]。后期去除主要通過向葡萄汁或葡萄酒中加入明膠、膨潤土和活性炭等澄清劑澄清，這是生產過程中從葡萄酒中除去OTA的重要途徑。還可以通過對水分活度、溫度、pH和衛生等的控制來減少生產、貯存和銷售過程中OTA的產生和污染。利用酵母吸附OTA是一種有前途的生物方法，CARRASCO-SANCHEZ V等[25]研究發現，實驗中所有添加酵母的葡萄酒中OTA含量都降低，紅葡萄酒中的去除效果較好，其原因可能由于花色苷和OTA之間的化學鍵對酵母吸附OTA具有增強作用。

3 生物胺

生物胺（BAs）是一類具有生物活性的含氮低分子質量有機化合物的總稱，按結構可以分為脂肪族胺、芳香胺和雜環胺。

3.1 BAs的來源及影響因素

生物胺源于原料本身或生產、陳釀和貯藏過程[9]。發酵食品中的BAs主要是乳酸菌等微生物作用下由氨基酸脫羧或醛類物質在氨基酸轉氨酶的轉氨作用下形成的一種不良代謝產物[4]。攝入過量的BAs會引起頭痛、腹瀉、過敏等不良反應，嚴重時可危及生命[26]。人體中含有可以降解BAs的酶，但這些酶的活性會受到乙醇和乙醛的抑制，使脫毒效率減小[4]。葡萄酒中相關的BAs主要有組胺、腐胺和酪胺，組胺含量是葡萄酒生產衛生質量的指標之一[27]。李志軍等[28]分析250款國產葡萄酒中8種生物胺，其中組胺的含量為0～14 mg/L，檢出率為52%，其中含量高于10 mg/L（德國組胺限量）的占比1.2%，高于2 mg/L（瑞士、奧地利等國組胺限量）的占比23.2%。

前體氨基酸和具有脫羧酶活性的微生物的存在及它們的濃度是影響BAs含量的主要因素[29]。組胺的含量會隨著補充氨基酸含量的增加而增加[30]，菌種類型及接種量都對BAs的含量有影響，菌種類型對BAs含量的影響更顯著，且發酵完成后，BAs含量隨貯存溫度的升高而升高[31]。此外，酒齡、容器類型和乙醇濃度[30]等對BAs的產生都有影響，陳釀時間較短的葡萄酒和陳釀在橡木桶中的葡萄酒BAs含量相對較高[32]?？傮w來說，菌種類型及含量直接影響酶活性及與前體物質反應的效率，其他因素則可能會通過影響酶活性或前體物質含量間接影響BAs的生成。

3.2 生物胺的檢測及防控方法

生物胺的檢測方法有色譜法、毛細管電泳法[33]和生物傳感器法[34]等。液相色譜在BAs檢測中應用最廣泛，但成本高。薄層色譜法則具有簡便、廉價的優勢，ROMANO A等[35]改進了一種適用于常規葡萄酒分析，能實現組胺、酪胺等幾種生物胺的高通量檢測的新型薄層色譜法。

生物胺的防控可以根據需要控制生產過程及貯存條件來減少BAs的形成[30]，嚴格控制衛生條件，避免外來微生物的污染，選用少量產生或不產BAs的菌株，選擇適當的發酵、貯存溫度等。CARMEN B等[26]首次發現，一株本地酒酒球菌用于蘋果酸-乳酸發酵，可顯著降低組胺的生成，與未接種的對照相比減少了5倍，接種一年后，比未接種的低3倍。此外，還可以通過定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerasechain reaction，qPCR）測定生物胺產生菌含量，預測葡萄酒中生物胺的積累風險，從而進行控制[29]。

4 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一類能產生溶血素、腸毒素和殺白細胞素等多種毒素和酶的致病菌。是一種常見的感染源，也是一種常見的人類共生菌[36]，能引起食物中毒和許多感染性疾病，對公眾健康構成了嚴重的威脅[5]。

4.1 金黃色葡萄球菌的來源及危害

金黃色葡萄球菌廣泛存在于空氣、水、灰塵、人類和動物排泄物中[37]，原料、生產者、加工設備等都是S.aureus污染的可能來源。其生長受溫度、水分活度、pH值等因素的影響，這些因素會通過影響它的生理活性而影響毒素和酶的產生。李金春等[38]研究發現：在一定的范圍內，金黃色葡萄球菌生長速率隨著溫度、pH值和水分活度的增加而增加。據美國疾病控制中心數據顯示，由S.aureus引起的食物中毒排名第二[5]，S.aureus還有會導致心內膜炎、膿腫和休克綜合癥等[37]。

4.2 金黃色葡萄球菌檢測及防控方法

平板法[39]作為S.aureus檢測的傳統方法，具有靈敏、廉價的特點，被視為黃金標準，但操作復雜、耗時，所以目前生物傳感器、免疫學、分子生物學等快速檢測方法逐漸得到發展[5]，但較高的成本和復雜的程序一定程度上限制了這些方法的使用[40]。SHAN Y Q等[40]研制了一種用于S.aureus特異性檢測的新型傳感器，將S.aureus單克隆抗體固定在作為捕獲探針的熒光微球上，熒光素標記的S.aureus抗體是指示信號，用熒光微球和熒光素雙重標記后，用多參數流式細胞儀對S.aureus進行富集觀察，該方法假陽性顯著減少，對S.aureus有較好的特異性。LIU C Y 等[37]采用變性氣泡介導的鏈交換擴增（strand exchange amplification，SEA）核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）一步法進行研究，設計了一對S.aureus的特異性引物，進行SEA反應，肉眼即可觀察到擴增反應的結果，從淺黃色到紅色顏色變化明顯，從而實現了S.aureus的檢測；該法與電鍍法有很大的一致性，且較簡單省時，無需昂貴設備。此外，還有多重PCR檢測、酶聯免疫吸附法、石化膜法[41]等方法。

葡萄酒中S.aureus的防控可以從外部防控和內部調控兩方面進行。通過選用優質衛生的原料，保證從業人員的健康及加工用具的衛生等來防止S.aureus的外來污染是預防污染最有效的方式；還可通過對溫度、水分活度和pH的適當調控來抑制S.aureus的生長和毒素的產生。近年來，還有許多關于蘆丁[42]、精油[43]、檸檬酸[44]等天然提取成分用來抑制S.aureus生長的研究，具有很好的應用潛力。

5 2,4,6-三氯苯甲醚

2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）是一種由青霉、曲霉、放線菌和鏈霉菌等真菌引起的甲基化產物[6]。TCA主要是通過影響葡萄酒的感官品質，給葡萄酒行業造成巨大的經濟損失，對人體健康的影響目前尚未見報道。

5.1 TCA的來源及危害

葡萄酒中的TCA污染主要是由真菌降解木塞中的氯酚形成的[45]，是葡萄酒中“木塞味”的主要來源。此外，TCA污染還可能來自殺菌劑、漂白劑和橡木桶等，其中可能含有氯酚等能通過氯化和甲基化反應形成TCA的成分[46]。木塞味會一定程度上掩蓋葡萄酒本身的香氣[47]，對葡萄酒的質量造成影響。每年受TCA污染的已裝瓶葡萄酒約占5%～7%，損失達100億美元[48]。報告顯示，軟木塞遷移到葡萄酒中的TCA質量濃度為2.4～210.0 ng/L[49]，而消費者對TCA的感知閾值和排斥閾值分別為2.1×10-12g/L和3.1×10-12g/L[50]。TCA污染給世界葡萄酒生產和消費帶來嚴重的負面影響。

5.2 TCA的檢測及防控方法

TCA的常規檢測方法有色譜法、傳感器法和感官方法[46]。色譜法是最常用的方法，其中，氣相色譜法是目前應用最廣泛的方法[46]。GC系列方法有很多，如濁點萃取-氣相色譜質譜法[51]和頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯質譜法[52]等。近年來，生物傳感器以其小型、廉價、可持續的自動化系統的優勢，有潛力替代傳統分析方法（HPLC、GC），相關的研究主要集中在利用抗體、細胞或它們的組合作為生物識別元件或以無創光學檢測為原理的生物分析法上[53]。APOSTOLOU T等[54]改進了一種基于特異性抗體的便攜生物傳感器，分析速度快，能夠在5 min內檢測到極低質量濃度的TCA（低至0.2 ng/kg），便攜，能直接用于現場檢測，實現高通量篩選軟木塞，且不需要任何輔助基礎設施。此外，還有紅外光譜[45]和熒光探針等[55]方法。

防止TCA污染，嚴格控制生產過程，保證原料、設備和環境等清潔衛生，避免真菌污染是關鍵；盡量減少含氯的殺蟲劑、漂白劑和防腐劑的使用；尋找軟木塞的替代品，如玻璃塞、螺旋塞等；采用特殊工藝方法去除，GUEDES P等[56]研究了從軟木塞中去除TCA的電化學工藝，發現低水平直流電的應用對TCA的減少有積極的作用，經電化學處理后78%的軟木塞的TCA水平低于檢測限值，此外軟木塞在鹽水溶液中浸泡24 h后，TCA去除率可提高10%～15%。

6 小結

本文介紹了氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素、生物胺、金黃色葡萄球菌和2,4,6-三氯苯甲醚五種影響葡萄酒質量和安全的生物性來源有害物質，著重從它們的來源、危害、影響因素、檢測方法及防控措施五個方面進行了闡釋。首先，從它們的來源、危害及影響因素方面進行了總結，如圖1所示。氨基甲酸乙酯是由尿素、瓜氨酸等幾種前體物質反應形成的，同時前體物質含量及反應過程又受原料、工藝、微生物和環境條件等多種因素的影響，過量攝入具有致癌性；赭曲霉毒素A是由曲霉等多種真菌產生，受到多種內在生長因素和外在環境因素的影響，過量攝入也具有致癌性；生物胺是由氨基酸或醛類產生的一組不良代謝產物，受微生物、葡萄品種和酒齡等因素的影響，能引起多種急性或慢性疾病；2,4,6-三氯苯甲醚主要來源于受霉菌等真菌污染的木塞，也可能來源于其他含氯的化合物，會給葡萄酒帶來不良的“木塞味”，造成葡萄酒感官品質下降；金黃色葡萄球菌污染一般是由原料或生產過程污染造成的，能分泌溶血素等多種毒素，造成溶血、組織壞死等多種病癥。

最后，對這5種生物性來源危害有害產物的檢測方法進行了歸納整理，如表2所示，以期為這些有害物質的檢測及防控提供一定的參考，這5種有害產物都可以采用HPLC和傳感器進行檢測；氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A、生物胺和2,4,6-三氯苯甲醚都能通過GC和光譜法進行檢測。

圖1 葡萄酒中生物性來源危害物質的危害流程Fig.1 Hazard flow of biological hazards substance in wine

表2 葡萄酒中生物性危害物質來源及檢測方法Table 2 Sources and detection methods of biological hazards substance in wine

7 展望

隨著大眾食品安全意識的提高，葡萄酒的質量安全問題也逐漸受到消費者的廣泛關注。相關的檢測技術和安全標準也在不斷完善與更新，但對于很多物質還是缺少經濟、簡便、準確、及時高效的適用于現場檢測的方法，不利于葡萄酒中有害物質的檢測；同時國內缺乏相應的標準體系，加上生產者安全知識匱乏及利益至上的生產方式，使得葡萄酒的質量安全狀況不容樂觀，造成各生產企業產品良莠不齊。本文闡釋和歸納了近年來研究較多的幾種葡萄酒生物性來源危害，這些危害主要來源于葡萄原料和釀造過程，因此對葡萄酒中有害代謝產物的防控要從源頭入手，實現生產優質原料，優化釀造工藝，并加快完善葡萄酒相關檢測技術，為生產高質量、安全的葡萄酒提供更為系統、全面的保障，推動我國葡萄酒產業健康發展。