膽道惡性腫瘤的生物學特性

李博 曹坤 左石

膽道惡性腫瘤(以下簡稱膽道腫瘤)是一種起源于膽管上皮細胞，具有多層次異質性、侵襲性的腫瘤，其發病率在全世界范圍內呈上升趨勢[1]。根據起源部位的不同，主要分為肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)、肝門部膽管癌(perihilar cholangiocarcinoma,PCC)、遠端膽管癌(distal cholangiocarcinoma,DCC)及膽囊癌。由于臨床表現較晚，缺乏特異性體征和癥狀，膽道腫瘤患者通常在晚期確診，導致治療選擇有限且預后不盡人意，即使早期經手術切除治療后，局部復發率也較高，總體5年生存率約30%[2]。化療可以提高晚期膽道腫瘤患者的存活率，是目前不能手術切除患者的首選治療措施，一線化療是吉西他濱聯合鉑類藥物，但整體生存響應率較低[3]。因此加入對膽道腫瘤生物學特征的研究在疾病早期篩查、早期診斷、早期治療等方面具有至關重要的臨床價值。隨著近年來基因組圖譜和生物信息學技術的顯著進步，綜合基因組圖譜研究不僅發現肝內外膽管癌的基因組異質性，還揭示了具有復雜相互作用的多個復發驅動因素的改變，使人們對膽道腫瘤的生物學特性有了更深層次的認識。本文將從遺傳學、表觀遺傳學、蛋白組學等相關方面對膽管癌生物學特性進行綜述。

一、基因組及表觀基因組與膽道腫瘤

下一代測序技術(next-generation sequencing,NGS)針對全基因組的分析發現，膽道腫瘤具有不同病因的基因突變、基因擴增、基因重排等生物信息。Jusakul等[4]對膽道腫瘤的全基因組和表觀基因組分析，揭示了膽道腫瘤的四個亞型，提出除解剖位置外,分子亞型可進一步提供膽道腫瘤的臨床病理學特性及分子生物學信息，其中亞型1/2富含ERBB2擴增和TP53突變，亞型3/4與BAP1和IDH1-2高突變相關，基于驅動基因與病因及臨床病理特征之間的聯系，發現僅亞型1/2與肝吸蟲感染有關。值得注意的是，相關研究通過突變譜進行分類，發現這種基因突變分類(IDH1-2/BAP1/PBRM1與KRAS/TP53)在單變量和多變量分析中都是患者生存率的有力預測因子[5]。此前研究顯示，TP53突變的ICC患者HBsAg多為陽性，而KRAS突變僅在HBsAg陰性的ICC患者中檢測到[6]。最近兩項基于多組學數據研究評估了膽道腫瘤的相關驅動因素，一項為Maeve A等的研究[7]，該研究通過NGS分析158例ICC病例發現最常見的改變基因是IDH1(30%)、ARID1A(23%)、BAP1(20%)、TP53(20%)和FGFR2基因融合(14%)；另一項為Robert等人的研究[8]，他們分析了150例PCC病例，發現KRAS(36.7%)、TP53(34.7%)、ARID1A(14.0%)和Smad4(10.7%)四種基因是最常見的基因突變。

二、表觀遺傳學與膽道腫瘤

腫瘤細胞和正常細胞在表觀遺傳特征上的差異是顯著的，通常與腫瘤抑制基因表達的喪失和癌基因功能的獲得有關，表觀遺傳信息通過各種生化修飾進行跨代傳遞，包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質重塑及非編碼RNA調控等。

1.DNA甲基化與膽道腫瘤:DNA甲基化是人類癌癥研究最廣泛的表觀遺傳學改變。在生物系統中，由DNA甲基轉移酶催化，與CpG甲基化結合蛋白相互作用，從而調節基因表達，維持或改變DNA的結構。哺乳動物的DNA甲基化通常發生在CpG島，全基因組研究表明，近60%的CpG島位于人類基因的啟動子中。DNA甲基化水平和模式的改變，如CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態與細胞周期、凋亡、增殖及腫瘤細胞發生發展相關[9]。SOX17啟動子在人膽管癌組織中高甲基化早有報道，另一項實驗通過研究SOX17在膽管癌中的表達及其潛在的表觀遺傳調控，發現SOX17在膽管癌組織和細胞系中表達下調，并證實了SOX17啟動子在膽道腫瘤組織中存在高甲基化，并進一步研究發現其表達與甲基化水平呈負相關[10]。既往的研究表明OPCML的高甲基化在膽道腫瘤組織中非常頻繁(72%)，而在癌旁組織中則不常見。最近，Wiphawan等[11]采用甲基化敏感高分辨熔融技術對膽道腫瘤患者血清游離DNA中OPCML、HOXA9基因甲基化進行定量分析，發現OPCML和HOXD9兩個甲基化基因聯合檢測的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為62.50%、100%、100%和72.72%。另一項研究中，通過對71例膽道腫瘤患者的腫瘤標本和對照的癌旁組織進行分析，發現以SHOX2和SEPT9甲基化作為標記物，區分膽道腫瘤和非膽道腫瘤的敏感性為45%，特異性為99%，并認為SHOX2和SEPT9啟動子甲基化可作為支持臨床標本診斷、發現和治療的生物標志物[12]。

2.組蛋白修飾和膽道腫瘤:染色質組織的基本單位是核小體，它由一個組蛋白八聚體復合物組成，周圍環繞著DNA。通過特殊的表觀遺傳酶對組蛋白進行翻譯后修飾，促進DNA修復和維持基因組的穩定。組蛋白的各種修飾，如甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等，都會改變二級DNA結構，從而改變基因表達。核心組蛋白N端的乙酰化受到組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白脫乙酰化酶(HDACs)的嚴格控制，HDACs去除組蛋白賴氨酸殘基上的乙酰基，導致染色質凝聚，抑制轉錄。HDAC介導的表觀遺傳學改變在膽道腫瘤發病機制中的重要性已被報道[13]。相關研究發現，HDACs2、HDACs3在膽道腫瘤組織中表達上調，且HDAC2和/或HDAC3高表達的患者預后較差[14]。另一項研究報道，HDAC3在膽道腫瘤中的表達存在差異，且與臨床病理因素相關，高水平的HDAC3在誘導膽道腫瘤細胞增殖的同時也抑制了癌細胞的凋亡[15]。大量研究表明，HDACs可通過多種途徑在致癌過程中發揮重要作用，HDACs抑制劑也可通過多種機制影響膽道腫瘤發生發展，發揮抗癌作用，深入探討兩者之間的分子機制將可能為膽道腫瘤治療靶點預測提供新的思路[16]。

3.非編碼RNA與膽道腫瘤:高通量技術已經使廣泛的基因組、外顯子組和轉錄組測序成為可能，也使得非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)的重要性得到證實，ncRNA在細胞分化、增殖、遷移、細胞周期調控和凋亡等多種基本細胞過程中發揮著重要作用。其中內源性非編碼單鏈RNA(micro RNA,miRNA)是包括增值和凋亡在內的各種生物過程的關鍵調節因子，在膽道腫瘤致癌狀態的啟動、維持和發展中起著至關重要的作用[17]。越來越多的證據表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在膽道腫瘤的發生發展中起著重要作用,異常表達的lncRNA能與DNA、RNA、蛋白質相互作用，可促進膽道腫瘤的惡性表型并預測膽道腫瘤細胞的不良預后，lncRNA可能成為是膽道腫瘤最具潛力的生物標志物或干預靶點[18]。相關研究通過檢測56例人膽道腫瘤組織及相應癌旁組織中LncRNA AFAP1-AS1的表達水平，發現膽道腫瘤組織中AFAP1-AS1表達增加，且AFAP1-AS1高表達患者總生存期較短，并認為AFAP1-AS1可作為膽道腫瘤一個新的潛在治療靶點[19]。進一步研究發現，LncRNA ZEB1-AS1具有較高的敏感性和特異性，可作為膽道腫瘤患者預后不良的獨立預測因子，ZEB1-AS1可通過結合miR-133b增加癌基因同源盒B8(HOXB8)的表達，從而促進腫瘤的增殖和侵襲[20]。大多數lncRNA除了充當內源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)的角色，可以調節相關的miRNA，也可直接作用于表觀調節因子從而影響腫瘤的發生發展。因此對膽道腫瘤中ncRNA的深入研究不僅能促進對其分子和功能作用的理解，還有望發現新的腫瘤標志物和新的治療策略。

三、蛋白組學與膽道腫瘤

蛋白組學指基因組表達的所有相應蛋白，即細胞、組織或機體全部蛋白質的存在及其活動形式，包括蛋白與蛋白相互作用、蛋白質的表達水平及翻譯后的修飾等。蛋白質組學已經在發現膽道癌生物標志物及治療靶標中得到驗證，細胞、組織、膽汁、血清等均可成為膽道癌生物學特征研究對象的重要來源[16]。研究發現，與正常膽汁相比，膽管癌患者膽汁中共有63個蛋白質顯著增加，其中，α-1抗胰蛋白酶陽性占70%[21]。另一項研究分析了膽道腫瘤和良性膽道疾病血清中的蛋白質差異，結果顯示FAM19A5、MAGED4B、KIAA0321、RBAK和UPF3B在腫瘤和非腫瘤患者中表達存在顯著差異，可作為區分膽道腫瘤和良性膽道疾病的新的生物標志物[22]。Le Faouder等通過非標記定量蛋白組學分析，發現ICC中，參與細胞黏附和運動(ITGA4、ITGA7、Rho GTPase)、細胞生長(TRAF3IP3)、凋亡抑制(BCL2)和血管生成(PDGFRb、VCAM1、PECAM1)相關的蛋白高表達[23]。PPP3CA作為鈣調神經磷酸酶的一個催化亞基，已被證明與腫瘤細胞的發生發展有關，Zengwei等[24]應用定量蛋白質組學分析膽道腫瘤與癌旁組織的差異表達蛋白質，發現233個差異蛋白表達，其中PPP3CA是膽道腫瘤預后不良的一個新的獨立因素。另一項研究采用同樣的方法，分析了2株膽道腫瘤細胞系，發現TPD52和DNAJB1在膽道腫瘤細胞系、組織和膽汁標本中的表達水平升高，提示這些蛋白可能參與了腫瘤的發生發展，進一步研究還發現TPD52和DNAJB1的表達水平與膽道腫瘤患者的臨床病例特征和預后密切相關[25]。

四、結語

膽道惡性腫瘤的發病分子機制十分復雜，診斷方面缺乏有效的生物標志物，包括生物靶向治療在內的現有治療方案難以取得令人滿意的治療效果。近年來，隨著多組學技術在高通量篩選的應用使得膽道腫瘤在診斷、治療、預后等相關的生物標記物研究得到廣泛認識，也促進了膽道腫瘤相關分子機制的研究。研究發現不同的解剖亞型和臨床亞型中存在不同的驅動基因異常，眾多候選分子讓科研人員進一步了解膽道腫瘤的生物學特性，但轉化為臨床實踐仍需要很長一段時間，因此對腫瘤相關分子探索的同時，應及時有效地從多組學方向分析已有的研究成果，尋找更具特異性及敏感性的分子或分子組合并驗證它們在膽道腫瘤診斷、治療及預后中的潛在用途。此外，實現多領域、多學科的綜合性研究將會為尋找有效地早期生物標志物提供廣闊的前景。