柳州地區15 個常用STR 基因座的遺傳多態性及突變分析

許澤輝 羅世強 唐寧 王秋華 鐘青燕 袁德健 蔡稔 崖嬌練 嚴提珍（通訊作者）

（柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室柳州市婦幼保健院醫學遺傳科 廣西 柳州 545001）

短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）是由2 ～6個核苷酸組成并存在于真核生物基因組中的DNA 串聯重復序列，具有高度多態性和孟德爾共顯性遺傳規律的特性，是目前廣泛應用于法醫物證學檢驗的多態性遺傳標記。而相應開發的聚合酶鏈式反應-短串聯重復（polymerase chain reaction-short tandem repeat，PCR-STR）檢測技術是國際法醫學界一項技術手段。AmpFLSTR ? Identifiler ? Plus 試劑盒在目前的親子鑒定實踐中得到了較廣泛地應用，它是采用五色熒光技術檢測15個STR 基因座和一個性別位點。雖然STR 基因座具有高度的遺傳穩定性，但物種的發展同樣不可避免發生突變。在親子鑒定中STR 基因座發生突變的現象近幾年均有報道[1-4]。本文作者通過親子鑒定案例回顧性分析，對AmpFLSTR ? Identifiler ? Plus 試劑盒15 個STR 位點進行觀察，分析了本地區STR 基因座的突變情況，為今后的親子鑒定提供頻率計算的基礎?，F報道如下。

1.資料與方法

1.1 樣本材料

2013 年3 月—2017 年10 月7450 例來源于實驗室日常檢案且結論為肯定親權關系的家系樣本，其中三聯體家系2319 例，二聯體家系5131 例，樣本類型有血濾紙、帶毛囊毛發、羊水、絨毛等。

1.2 DNA 提取

采用Chelex-100 法提取樣本基因組DNA。

1.3 基因分型

常規采用AmpFLSTR ? Identifiler ? Plus 試劑盒（美國life 公司）對基因組DNA 直接PCR 復合擴增，若出現疑似突變現象，二聯體父女或母女，二聯體父子或母子，三聯體分別采用X-STR、Y-STR、PowerPlex24 等進一步驗證。擴增產物使用ABI3500Dx 遺傳分析儀（美國life 公司）按相應儀器使用說明書進行擴增產物片段分析，應用GeneMapper ID-X v1.4 軟件進行基因分型分析。

1.4 突變基因座、來源、步數的確定

用AmpFLSTR ? Identifiler ? Plus 體系進行檢測，若基因座上遺傳位點有1 ～2 個違反遺傳規律，參照“親權鑒定實驗室規范及技術標準建議”計算累計親權指數（paternity index，PI）、增加X-STR 或Y-STR 檢測[5]。若累計PI ＞10000，且X-STR 或Y-STR 符合遺傳規律，則判定有親權關系，違反遺傳規律的基因座則視為突變位點。突變等位基因來源的確定[6]，將子代發生突變等位基因座與其親代父方或母方的等位基因相差最小步數的等位基因視為突變等位基因來源方；突變等位基因座的增加或減少的多少為突變步數，若同時存在同步數的增加或減少可能，則視為不確定來源方，本研究增加或減少一步突變以+1、-1 表示，增加或減少二步突變以+2、-2表示，依次類推。若突變為純合子，要排除檢測試劑盒的原因而導致實驗錯誤。

1.5 統計及分析

根據STR 基因座突變率的計算公式：STR 基因座的突變率=突變STR 基因座數/（雙親案例數×2+單親案例數）來計算每個STR 基因座突變率，由直接計數法得出具有STR 基因座突變的案例數，并分析相關影響因素。并使用χ2檢驗，來評估各統計量是否存在顯著差異。

2.結果

2.1 STR 基因座突變分析結果

統計7450 例判定為親子關系的案例，三聯體親子鑒定有2319 例案例，單親二聯體親子鑒定有5131 例案例，共觀察到9769 次減數分裂。在15 個檢測基因位點中觀察到一個STR 位點突變有109 例案例，突變位點涉及到13 個基 因 座（D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P O、D3S1358、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、D18S51、D5S818 和FGA），其中以FGA 基因座的突變率最高（1.84‰），突變率最低基因座為D2S1338，該所有檢測基因座中僅T H01和TPOX 沒有檢測到突變情況，其余都檢測到有突變情況。根據文獻分別對觀察到的109 例突變率進行計算[7-8]，STR 基因座突變率見表1。

表1 STR 基因座突變率匯總

2.2 STR 基因座突變步數

觀察并比較同一家系突變基因座的等位基因型，STR基因座突變步數情況見表2。三聯體突變有34 個案例，二聯體突變75 個案例，其中一步突變101 次（92.66%），二步突變1 次（0.92%），三步突變4 次（3.67%），四步突變3 次（2.75%）。

表2 STR 基因座突變步數情況

2.3 突變等位基因來源

109 個案例中檢測到突變等位基因座來自父源的有98 例，占突變基因座的89.91%，來自母源的9 例，占突變基因座的8.26%，無法確定來源2 例，占突變基因座的1.83%。父源突變率與母源突變率比例為98：9，約10：1（χ2=74.02，P＜0.01）。見表3。

表3 STR 基因座突變來源匯總

3.討論

3.1 STR 基因位點的突變頻率分析

基因突變一般是DNA 在復制過程中，DNA 聚合酶滑動造成子代重復序列中核心序列的改變引起的。本研究通過對柳州地區7450 例親子鑒定案例的分析，發現109 例案例的基因座有突變發生，突變率在0 ～1.84‰之間。分析顯示FGA 基因座突變率較高，其次是D8S1179、D18S51、D19S433、vWA。突變頻率最高的FGA 基因座所占突變案例比例為1.84‰，與文獻報道的FGA 基因座突變率最高一致[9]，分析認為本地區少數民族人口比例多，不同地區人群突變存在差異性。這表明不斷累積不同地區人群的突變數據并共享數據，可以更好地為法醫學親子鑒定服務。據李成濤等[10]分析認為STR 基因座核心序列重復次數越多，其基因突變率相對越高，本研究15 個基因位點中基因突變率最高的FGA 其重復范圍高達12.2 ～51.2。相對于等位基因重復范圍較小的基因座TH01 和TPOX，在本次沒有發現突變現象，也證明了等位基因范圍越小，突變率越低，所以在親子鑒定選取STR 位點時應將突變頻率和人群特異性的因素考慮在內。

3.2 STR 基因位點的突變模式分析

在本次109 例突變案例中，一步突變101 例，占92.66%；二步只有1 例，占0.92%；三步突變3 例，占3.67%；四步突變4 例，占2.75%。未發現有五步或更多突變情況。同時發現一步突變為主要的突變形式，三步以上的突變，發生突變的子代或親代基因座都為純合子，且僅出現在D8S1179 基因座等位基因。本次使用不同試劑盒檢測驗證，但沒有進行基因測序，不可以排除基因座丟失的可能性。對D8S1179、D18S51 等位基因出現不符合遺傳規律的現象，且基因座為純合子時，要特別注意，需進一步進行分析驗證。

3.3 STR 基因位點突變的性別差異

根據多位學者報道[1-4]，基因座突變來源主要是來自父源，母源突變比例較低。本次來自父源的突變例數所占突變例數高達98 例，占89.91%，母源9 例，不確定例數為2 例，父源所占比與母源所占比的比例約為10 ∶1，具有統計學差異，與其他報道的比例相近[1-4，8，9]。一般認為，父源突變率與母源突變率不同的因素，主要是減數分裂次數越多，產生變異概率越大。本次主要人群以二聯體為主，且是父子二聯體為主，表現為父源性突變率比例明顯偏高，與邱平明等[9]報道一致。同時，排除近親，追加父方或母方樣品檢測，降低誤判風險[9]。

綜上，無論對三聯體還是二聯體，特別是父子二聯體進行親子鑒定時，注意突變現象的存在，尤其注意純合子及多步突變，而且選取突變率低，穩定的基因座進行檢測，配套其他遺傳標記試劑相互認證，按各基因座突變率計算親權指數，累積更多不同地區人群的突變數據，提高親子鑒定結論判定的準確性。