福建省禽源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

陳秀琴 張世忠 江 斌 林 琳 鄭 敏 林 黃梅清＊

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心 福州 350013）

大腸桿菌普遍存在于環境中， 包括哺乳動物和禽類的消化道內，其中的部分血清型可致病，成為環境、食品、水等污染的重要指示細菌[1]。 此外，畜禽源致病大腸桿菌還可傳染人，從而引發各種疾病[2]。 禽大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌引起的多種病的統稱，包括大腸桿菌性氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎等[3]。

禽養殖場中普遍使用小劑量抗生素用于促生長和預防疾病， 但是持續使用抗生素會導致細菌產生耐藥性。大部分抗生素并不能完全在腸道內被吸收。有文獻報道給雞飼喂的抗生素高達90%隨糞便排出體外[4]，從而導致細菌產生耐藥性。 據估計，歐洲每年大約有超過3.3 萬人死于抗生素耐藥感染，到2050 年， 全球每年將有1 000 萬人死于抗生素耐藥[5]。 為了解福建省禽源大腸桿菌的抗生素耐藥性情況， 對若干個發病養殖場進行大腸桿菌分離鑒定及藥物敏感性研究， 以期為福建省禽大腸桿菌病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源 2018-2019 年采集于福建省中大型養禽場。

1.2 培養基與試劑 麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、革蘭氏染色液及大腸桿菌IMViC 生化鑒定盒均購自廣東環凱微生物科技公司， 藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離純化 取病死禽的心、肝直接在麥康凱瓊脂平板上劃線培養，于37 ℃培養24 h，挑取單個紅色菌落接種于普通營養肉湯，37 ℃、150 r/min振蕩培養12 h。 將培養好的菌液置于4 ℃冰箱，用于生化試驗鑒定及藥物敏感性試驗。

1.4 生化試驗 將符合大腸桿菌形態特征的細菌，按照說明書要求接種于大腸桿菌IMViC 生化鑒定試管中 （靛基質、MR、VP、 枸櫞酸鹽），37 ℃培養24 h，觀察并記錄結果。

1.5 藥敏試驗 吸取100 μL 經鑒定好的大腸桿菌菌液到營養瓊脂培養基上，用L 型一次性涂布棒涂抹均勻， 待菌液完全被培養基吸收后， 選取以下10 種常用抗生素：丁胺卡那霉素、多黏菌素B、復方新諾明、慶大霉素、頭孢菌素、四環素、呋喃唑酮、鏈霉素、林可霉素、多西環素，將藥敏片貼到營養瓊脂表面，37 ℃培養18 h 后，觀察測量抑菌圈的大小。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離鑒定結果 分離菌株在麥康凱瓊脂平板上形成紅色、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊的菌落；該菌落在伊紅美藍平板上呈紫黑色、表面光滑濕潤并帶有金屬光澤；培養物進行革蘭氏染色，鏡檢結果為革蘭氏陰性、 兩端鈍圓的短桿菌。 根據以上判斷方法， 從20 份樣品初步分離到15 株禽源大腸桿菌，包括10 株雞源大腸桿菌和5 株鴿源大腸桿菌。

2.2 生化鑒定結果 將分離的15 株細菌進行大腸桿菌IMViC 生化試驗鑒定， 結果15 株細菌靛基質試驗和MR 試驗均為陽性，VP 試驗和枸櫞酸鹽試驗均呈陰性。 以上生化試驗結果均符合經典大腸桿菌的生化特征。

2.3 藥敏試驗結果 對分離的15 株禽源大腸桿菌進行藥物敏感性試驗。藥物敏感性的判斷標準如下：抑菌圈直徑15.1～20 mm 者為高度敏感；直徑10.1～15 mm 者為中度敏感； 直徑在10 mm 及以下者為耐藥[6]。 由表1 可知，大部分菌株對復方新諾明（13/15）、頭孢菌素（10/15）、四環素（12/15）、林可霉素（14/15）、多西環素（10/15）耐藥；部分菌株對多黏菌素 B（9/15）、呋喃唑酮（9/15）中度敏感；大部分菌株對丁胺卡那霉素（10/15）高度敏感。

3 討 論

大腸桿菌是一種條件致病菌， 它廣泛存在于飼料、墊料、空氣中，在動物機體抵抗力下降、冷熱應激、 環境惡劣等情況下可誘發大腸桿菌病。 所有日齡的禽都可發病，尤其是雛禽更易發。禽大腸桿菌病在養殖場中廣泛存在， 容易造成家禽感染發病甚至死亡，使養殖場遭受經濟損失[7]。

本試驗從福建省多個規模化養殖場分離到15 株禽源大腸桿菌。 通過革蘭氏染色結果為革蘭氏陰性菌； 在麥康凱瓊脂選擇培養基和伊紅美藍鑒別培養基上培養，結果均符合大腸桿菌的特性；生化試驗結果表明，所分離的15 株細菌均為大腸桿菌。 藥物敏感性試驗結果表明，大部分菌株對復方新諾明、頭孢菌素、四環素、林可霉素、多西環素耐藥；部分菌株對多黏菌素B 和呋喃唑酮中度敏感；大部分菌株對丁胺卡那霉素高度敏感。在養殖生產中，由于大量無規范地使用抗生素， 且大量的抗生素隨動物排泄物排到環境中，導致細菌耐藥性不斷加強[8]。 因此，養殖場應加強對大腸桿菌耐藥性的監測， 使用敏感藥物治療，避免盲目使用抗生素。

表1 分離菌株藥敏試驗結果