鵝圓環病毒JX1 株ORF3 基因序列分析

萬春和 黃 瑜

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省禽病防治重點實驗室/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心 福州 350013；2.龍巖學院/預防獸醫學與生物技術福建省高校重點實驗室 福建龍巖 364012）

根據國際病毒分類委員會 （International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV） 最 新 分 類（https://talk.ictvonline.org/taxonomy/）， 鵝 圓 環 病 毒（Goose circovirus，GoCV）屬于圓環病毒科（Circoviridae）圓環病毒屬（Circovirus）成員。

GoCV 病毒顆粒為無囊膜、二十面體對稱、單股負鏈環狀閉合DNA 病毒， 直徑約15 nm。 GoCV 于1999 年由Soike 等從生長發育不良、 體重下降的患鵝中發現[1]。 隨后 ，GoCV 在我國臺灣[2]、浙江[3]、江西[4]、廣東[5]、山東[6]、福建[7]、重慶[8]、廣西[9]等多地鵝群中發現。 GoCV 基因組全長為1 821 nt 左右，其5'-端具有典型的頸環結構， 其頂部有1 個保守的9 堿基序列“TATTATT①AC”（①position 1）；其 3'-端基因間區存在正向或反向的重復序列。 與其他圓環病毒屬成員基因組結構類似，GoCV 還編碼有兩個大的開放閱讀框（ORF），位于病毒左側與病毒復制相關的非結構蛋白（Rep）和位于右側抗原相關的結構蛋白（Cap）[1-4]。

近年來，在鴨圓環病毒（Duck circovirus，DuCV）基因組中除ORF-V1 和ORF-C1 兩個主要ORF 之外，新鑒定的位于ORF-V1 互補鏈上的第三個功能性ORF，命名為 ORF3[10]。 對 DuCV 的 ORF3 基因分析發現，ORF3 基因在鴨圓環病毒兩大基因型（DuCV-G1 和 DuCV-G2） 存 在 特 征 性 差 異 ，即DuCV-G1 的 ORF3 基因大小均為 237 bp， 編碼78 個氨基酸； 而DuCV-G2 的 ORF3 基因大小均為297 bp，編碼98 個氨基酸；同型之間氨基酸的同源性為 89.9%～100%， 而兩型之間氨基酸的同源性只有72.2%～81.0%。進一步對DuCV-G1 和DuCV-G2 ORF3 基因分析比對發現， 由于DuCV-G1 的ORF3基因發生T236A 突變（由TTG 突變為TAG，產生新的終止子（Premature stop condon）導致翻譯提前終止， 使 DuCV-G1 比 DuCV-G2 的 ORF3 基因 3'-末端縮短 60 個核苷酸（即 20 個氨基酸）[11]。

目前，尚未見GoCV ORF3 基因的研究報告，本研究通過分析本團隊前期鑒定的GoCV JX1 株（GenBank 登錄號：GU320569）[4]基因組 ORF3 基因特征， 為后續開展GoCV ORF3 基因功能研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 毒株 朗德鵝源 GoCV（JX1 株，GenBank 登錄號：GU320569）[4]由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所鑒定并保存。

1.2 JX1 株ORF3 基因基本理化特性分析 經序列分析，JX1 株ORF3 基因位于ORF-V1 互補鏈上127 至 426 位，其基因全長為 300 bp，編碼 99 個氨基酸，分子量為11 583.22 Da，理論等電點（Theoretical pI） 為 8.84； 總原子數為 1 619， 其組成為C515H802N154O144S4，帶負電荷氨基酸（Asp+Glu）為 8 個，帶正電荷氨基酸（Arg+Lys）為 10 個；不穩定指數為80.95，是一個不穩定蛋白；脂肪系數89.70，總平均疏水性指數為-0.472。

1.3 GoCV 序列分析

1.3.1 全基因組遺傳進化分析 由于DuCV 不同基因型ORF3 基因存在特征性差異， 為探討 GoCV ORF3 基因是否存在類型現象， 本研究先對Gen-Bank 中登錄的 GoCV 全基因組序列 （共 67 株GoCV）進行遺傳分析。 利用 MEGA6.0 軟件[12]繪制GoCV 全基因組遺傳進化樹， 繪制遺傳進化樹采用NJ 法 （Neighbor-Joining Methods）， 重 復 計 算1 000 次（Bootstrap=1 000）。

1.3.2 ORF3 基因遺傳進化分析 將上述 67 株GoCV 的 ORF3 基因利用 MEGA6.0 軟件繪制 ORF3基因遺傳進化樹， 繪制遺傳進化樹采用 NJ 法（Neighbor-Joining Methods）， 重 復 計 算 1 000 次（Bootstrap=1 000）。

1.3.3 ORF3 基因核苷酸同源性比較 利用Lasergene MegAlign 軟件（By Clustal W Method），將 JX1株與其他66 株GoCV 的ORF3 基因進行核苷酸同源性分析， 比較JX1 株與其他ORF3 基因不同遺傳進化分支毒株的核苷酸同源性。

2 結 果

2.1 全基因組遺傳進化分析 從GoCV 全基因組遺傳進化分析可見 （見圖1）， 可分為5 個基因型（Genotype 1 至 Genotype 5）。 其 中 Genotype 3 型（7 株）、Genotype 4 型（1 株）和 Genotype 5 型（2 株）均為歐洲波蘭分離株， 其余57 株均處于經典的Genotype 1 型和Genotype 2 型。需要指出的是，波蘭地區的GoCV 全基因組遺傳進化均為復雜[13]，Genotype 2a1 亞型和Genotype 2a2 亞型也有分布， 且歐洲其他地區流行的GoCV 也均處于Genotype 2 型內的Genotype 2a1 亞型和Genotype 2a2 亞型。

2.2 ORF3 基因組遺傳進化分析 從ORF3 基因組遺傳進化分析可見（見圖2），同樣可分為5 個遺傳進化分支（Clade 1 至Clade 5），但其與全基因組基因分型存在很大不同，Clade 1 分支GoCV 均為中國株，其中中國臺灣省GoCV 均處于Clade 1a 亞分支，中國其他地區GoCV 則分別處于Clade 1b 亞分支、Clade 1c 亞分支和 Clade 1d 亞分支； 歐洲地區GoCV 則分處于 Clade 2 分支、Clade 3 分支、Clade 4分支和Clade 5 分支。

2.3 ORF3 基因分析 對所有 67 株 GoCV 的ORF3 基因進行分析發現， 其中 60 株 GoCV 的ORF3 基因長度與 JX1 株一致， 均為 300 bp。 但是6 株 GoCV （G1 株、G4 株、G9 株、G15 株、G16 株、GoCV-Hun2 株）的 ORF3 基因長度為 309 bp；需要指出的是， 該6 株GoCV 在ORF3 基因進化上均處于Clade 2 分支， 但處于Clade 2 分支的其他GoCV的ORF3 基因長度均為300 bp， 關于該差異的生物學意義還需要作更進一步深入研究。

2.4 ORF3 基因核苷酸同源性比較 從核苷酸同源性分析比較結果可見，JX1 株與 yk1 株（AY633653）、yk3 株（DQ192280）的核苷酸同源性最高，均為100%；與DG1 株的核苷酸同源性最低，僅為89.0%。

3 討 論

圖1 GoCV 全基因組遺傳進化分析

圖2 ORF3 基因組遺傳進化分析

目前， 對于圓環病毒科圓環病毒屬豬圓環病毒1 型和 2 型（PCV1 和 PCV2）的 ORF3 基因功能研究較多，且研究發現，PCV1 和 PCV2 與 DuCV 類似，其中PCV1 （對豬群不致病） 的ORF3 基因大小均為237 bp， 編碼 78 個氨基酸；PCV2 （對豬群致病）的ORF3 基因大小均為 315 bp， 編碼 104 個氨基酸[14]。Liu 等通過構建ORF3 缺失突變體病毒與野生型病毒比較發現，ORF3 缺失突變株不影響PCV2 復制，但參與了外源性細胞凋亡。 通過測定caspase 3、caspase 8 和 caspase 9 基因表達發現，PCV2 誘導的細胞凋亡需要激活caspase 8 （而不是caspase 9），caspase 8 的激活導致caspase 3 的激活，使感染細胞中caspase 底物的裂解。 研究還發現，PCV2 的ORF3與 P53 競爭結合 pPirh2，通過干擾 pPirh2 對 P53 泛素化， 從而誘發了P53 介導的凋亡通路。 PCV2 的ORF3 蛋白通過與胞漿中G 蛋白信號調節因子（RGS16）相互作用，導致RGS16 發生泛素介導的蛋白酶降解，從而促進NF-kB 通過ERK1/2 信號通路移位胞核內，增強IL-6 和IL-8 的轉錄，因而在細胞周邊誘發嚴重的炎性反應和白細胞浸潤， 這可能也與PCV2 致病性相關[15-16]。研究還發現，過表達PCV2的ORF3 蛋白可誘導豬外周血淋巴細胞（PBMCs）凋亡[17]。 但有意思的是，對 PCV1 的 ORF3 蛋白誘導的細胞凋亡研究結果表明，PCV1 的 ORF3 蛋白比PCV2 的ORF3 蛋白可誘導更多細胞發生凋亡[18]。

對于 DuCV 的 ORF3 基因功能研究發現，DuCV-G1 的 ORF3 比 DuCV-G2 的 ORF3 對 禽 源DF-1 細胞表現出更高的凋亡能力； 且缺失DuCVG2 的 ORF3 末端20 個氨基酸后的 ORF3 （長度與DuCV-G1 的ORF3 一致）表現出更高的促宿主細胞凋亡能力[19-20]。 但是， 通過對 67 株 DuCV-G1 的ORF3 基因分析發現，不同遺傳進化分支的ORF3 基因長度卻與 DuCV 兩個基因型 （DuCV-G1 和DuCV-G2）、PCV 兩個基因型（PCV1 和 PCV2）存在特征性差異及核定位信號差異明顯不同， 雖然有6株GoCV 的 ORF3 基因為 309 bp，但是與其他 61 株GoCV 的ORF3 基因編碼區氨基酸序列一樣，均不存在典型的核定位信號[21]。

研究還發現，GoCV 全基因組與ORF3 基因的遺傳進化分析結果存在明顯不同， 雖然絕大部分GoCV 從全基因組遺傳進化分析也可以同樣分為兩個大的基因型， 但是卻與ORF3 基因的遺傳進化分析結果存在明顯不同， 尤其是ORF3 基因的遺傳進化表現為明顯的地域性，但并不表現出時間性；上述結果表明，ORF3 基因的進化頻率并不完全與GoCV全基因組一致， 具體機制還需要作更進一步的深入研究。