多灶肝細胞癌異質性的多組學研究與臨床意義

匡 銘, 許麗霞, 劉 信, 章 穎, 沈順利

中山大學附屬第一醫院 a.肝外科； b.腫瘤科； c.放射治療科， 廣州 510080

肝細胞癌(HCC)是一種原發于肝臟的惡性腫瘤，高居全球癌癥死亡率的第四位[1]。我國每年新診斷的HCC患者約46.61萬例，每年大概有42.21萬例患者死于HCC，發病及死亡人數均接近世界的一半[2]。HCC的惡性程度高，復發率高，預后較差。據報道[3-5]，有50%～75%的HCC在診斷時已是多個病灶，治療方式十分有限且效果不佳。

對于多灶HCC，剩余肝臟儲備功能的不足極大增加了手術切除的難度，即使可以順利手術，患者術后5年復發率仍高達70%～80%，極高的復發率導致患者預后不良[6]，預防復發是實現HCC患者長期生存的關鍵[7]。然而，在STORM研究[8]中，索拉非尼作為一線靶向藥物，并沒有降低根治性治療后HCC患者的復發率。HCC高度的異質性被認為是治療失敗的主要原因[4,9]。此外，對于失去根治性治療機會的晚期HCC患者，靶向治療作為一線治療方案，其中位無進展生存時間僅為3.6～7.3個月[10-11]，不良反應的發生率超過80%。越來越多的臨床研究結果顯示免疫治療是晚期HCC很有前景的治療手段。免疫檢查點抑制劑，如細胞程序性死亡蛋白-1(programed cell death protein-1，PD-1)抗體治療晚期HCC患者的一線治療總體生存時間為28.6個月，二線治療總體生存時間為12.9～15個月[12-14]。然而，PD-1抗體治療HCC的總體響應率低于20%[13-14]。藥物靶點和免疫微環境的異質性被認為是臨床上靶向和免疫治療療效不一的主要原因[15]。

相比于單個病灶，多灶HCC的腫瘤異質性更為復雜[16-18]。HCC的多個病灶可能來源于多個中心或者是同一個原發灶的肝內轉移[19]。近來多個研究從基因突變、拷貝數變異(copy number alterations，CNAs)、結構變異(structure variations，SVs)和HBV DNA的整合位點[20-24]的角度評估了多灶HCC的腫瘤起源和基因組異質性。此外，多灶HCC的轉錄異質性，尤其是免疫的異質性與免疫治療反應有關[23-25]。

本文基于多灶HCC的基因組和轉錄異質性研究領域的文獻報道，并結合作者的研究成果，重點介紹多灶HCC的腫瘤起源、基因組結構、克隆進化以及不同病灶間的RNA表達和腫瘤免疫微環境特征，并探討上述異質性對多灶HCC精準診療的影響。

1 多灶HCC的基因組特征

1.1 多灶HCC的起源種類及基因組特征 多灶HCC可分為多中心起源HCC(multicentric occurrence HCC，MO-HCC)和肝內轉移HCC(intrahepatic metastases HCC，IM-HCC)兩種類型，臨床預后差別巨大。MO-HCC的起源是一種多克隆的過程[26]，意味著各病灶從起源時就有著相互獨立的克隆來源。這種類型的多灶HCC患者進行根治性手術治療的效果較好，且即使術后復發，仍能從二次手術或局部治療中獲得較好的治療效果。相比之下，IM-HCC則由相同克隆來源的腫瘤細胞發生肝內轉移，此種類型腫瘤的生物學行為更具侵襲性，患者接受手術治療后常早期即出現復發[27]，即使采取更為激進的治療方式，預后仍然較差。因此，區分這兩種不同來源的HCC對優化多灶HCC患者的預后判斷具有重要意義。

傳統方法如觀察腫瘤的組織病理學形態[28-29]，檢測p53等高頻突變蛋白[30]等難以區分IM-HCC和MO-HCC。越來越多的研究[21,26,31-32]利用全基因組/外顯子組和轉錄組測序來識別一些生物標志物，從而區分腫瘤的起源。采用基因組和轉錄組分析，Miao等[31]探究了兩例多灶HCC患者腫瘤的克隆起源及其接受根治性手術治療后預后的差異。患者1不同病灶間的基因突變模式、CNA譜、SV特征和HBV DNA整合位點十分相似，該患者的多發病灶被認為是IM-HCC，在根治性手術后3個月即死于復發。患者2的各個病灶之間具有明顯的HBV DNA整合位點和基因組突變的差異，其多發病灶被認為具有獨立的來源(MO-HCC)，且轉錄組功能分析結果顯示，該患者沒有發現任何一個在前一例患者中發現的與侵襲轉移有關的分子特征。該患者術后2年仍然處于無瘤生存狀態[31]。

越來越多的研究發現，同一多灶HCC患者不同病灶間，基因突變譜、CNAs、SVs和腫瘤克隆進化存在很明顯的異質性。不同多灶HCC患者之間，所有病灶共有的基因突變比例差異較大。研究[4,32-33]表明，IM-HCC的共有基因突變比例在8%～97%，而MO-HCC不同病灶間幾乎沒有相同的基因突變。CNAs在多灶患者不同病灶間也存在較大的異質性。例如，在IM-HCC中，共有CNAs的比例為22.2%～100%，MO-HCC不同癌灶間共有的CNAs最高為46.7%[26]。作者采用全外顯子組及全基因組測序技術，也證實了多灶HCC患者不同病灶間基因突變和CNAs存在較大的異質性[23]。HBV感染者在肝癌發生前，HBV DNA與宿主基因組的隨機位點結合，使得這個位點結合信息對每一個腫瘤克隆都是特異的。因此，具有相同HBV DNA整合位點的病灶被認為是肝內轉移灶[32]。包括作者研究在內的多項研究[24,26,34]顯示，IM-HCC中HBV DNA整合的模式相同，而在MO-HCC中HBV DNA整合的模式不同，進一步證實了上述觀點。此外，在不同病灶中基因組SVs的數目存在差異[21]，Miao等[31]在多灶HCC的不同灶中發現了13～26個數目不等的SVs。作者的研究結果則顯示在同一患者中，較小病灶的SV數量與較大病灶相比，有增加的趨勢[24]。

1.2 多灶HCC的克隆進化及其在精準靶向治療中的意義 遺傳起源與克隆進化分析進一步證實了多灶HCC的基因異質性。基于所有體細胞突變構建多灶HCC患者的遺傳進化樹發現，不同患者之間存在很大差異[23,26,31]。進一步將包括可靶向用藥等主要的驅動突變映射到每個遺傳進化樹中，只有9%～85%的驅動基因改變位于樹干[18]，這表明多灶腫瘤遵循腫瘤分支進化的模式[26,32]。作者的研究表明，只有30%(18/60)的驅動基因改變和20%(3/15)的藥物靶點位于遺傳進化樹的樹干，說明多灶HCC患者中不同病灶間存在著巨大異質性。值得注意的是，僅1/6患者的進化樹樹干中發現了索拉非尼靶基因的改變(如BRAF擴增、PDGFRB擴增和VEGFA擴增等)，這可能是臨床中索拉非尼治療反應率相對較低的原因[23]。筆者的研究表明，藥物靶點的異質性有助于解釋多灶HCC患者對靶向藥物治療反應不一的臨床現象。

研究驅動基因突變的克隆狀態有助于區分腫瘤克隆進化過程中的早期事件和晚期事件，靶向主要驅動基因克隆突變(早期事件)是一種較好的治療策略[35-38]。一些驅動基因突變在多灶HCC中顯示為克隆突變，如TERT、CTNNB1、TP53和BRAF，被認為是HCC復發的典型驅動基因[18,39-40]。通過全外顯子測序，研究人員還發現53.8%的致癌突變表現為亞克隆，位于進化樹的分支上[20]。多灶HCC的克隆和分支進化是HCC精準靶向治療的一大障礙。對于有手術機會的多灶HCC患者，對其所有病灶進行敏感靶點的檢測，尋找進化樹樹干上的共有敏感靶點，進行精準靶向治療，有望預防腫瘤復發。

2 多灶HCC的轉錄組特征

2.1 多灶HCC的RNA表達特征及通路分析 隨著RNA測序技術在多灶HCC的腫瘤組織和癌旁肝組織的應用，多灶HCC的轉錄組特征逐漸被揭示[23,31]。通過比較腫瘤和癌旁組織的基因表達水平，可鑒定上調和下調的基因種類和變化比率，進一步分析腫瘤的特征性基因變化譜。作者團隊通過基因本體分析發現多灶HCC中主要富集免疫反應和代謝過程相關的基因集[23]。同樣地，Miao等[31]也發現在多灶肝癌中免疫反應和代謝通路得到富集，這一結論在HCC的大規模多組學整合研究[40]中也得到了驗證，表明免疫和代謝這兩個通路的調節機制對于多灶HCC發生發展具有重要作用。Zhang等[32]報道了1例有9個病灶的多灶HCC，通過KEGG通路分析發現不同的病灶有著顯著不同的富集通路，但來自于相同病灶的取材點在轉錄組水平則更為相似，提示病灶間的異質性大于病灶內的異質性，這可能預示著在治療反應過程中，同一病灶的表型可能更為一致，而不同病灶則會存在差異，從而產生混合效應。作者在多灶HCC的大癌灶中發現更多的增殖相關通路富集，例如血管新生、血管內皮生長因子、PI3K-AKT等信號通路，而小癌灶則有更多的免疫相關通路富集，例如TNFα、IFNα、T淋巴細胞和B淋巴細胞受體信號通路等[24]。這些結果部分解釋了臨床多灶HCC患者在接受靶向治療或者免疫治療時不同病灶療效的異質性。

在前期的轉錄組數據分析中，作者發現Edmondson-Steiner分級為2級和3級HCC患者的RNA表達譜存在明顯的區別，提示RNA表達與腫瘤分化程度相關[23]。HBV相關HCC患者的臨床預后可以從轉錄組分析角度去判斷：細胞骨架的重構和細胞外基質的組裝與腫瘤轉移相關，臨床預后不佳可能與細胞增殖、核酸代謝、蛋白翻譯以及大分子組裝相關，提示RNA表達與腫瘤的臨床病理特征和預后相關[31]。此外，多組學分析可以預測多灶HCC的腫瘤增殖和侵襲能力，為術后的輔助治療提供指導[19]。因此，多灶HCC的RNA表達分析具有臨床預后的預測潛力，在臨床實踐中的應用前景十分廣泛。

RNA表達受到許多因素的影響，包括基因組和表觀遺傳的調控。RNA表達很大程度上受到基因組拷貝數的影響[31]，也可能源于甲基化水平的不同。Ding等[41]發現，早在多灶HCC發生之前，肝硬化或者纖維化的結節中已經發生了特征性的DNA 甲基化，并在肝臟中形成“場效應”，為腫瘤的發生和發展提供了具有選擇性的生存優勢。此外，RNA表達調控的其他表觀遺傳修飾例如m6A和m7G等研究也在探索中，相關機制的揭示有望為HCC的治療帶來突破。

2.2 多灶HCC轉錄組特征對精準免疫治療的指導意義

免疫治療在HCC治療中有著很好的應用前景，但其較低的反應率和不同病灶的混合效應仍然是目前面臨的最主要挑戰，HCC患者不同的癌灶間存在顯著不同的免疫微環境，包括免疫效應細胞、免疫抑制細胞、基質細胞、細胞因子、生長因子等，共同塑造了多灶肝癌免疫微環境的異質性。因此，從多灶HCC的免疫特征層面理解其免疫逃逸機制并開發更有效的免疫治療極為重要[4]。多灶HCC在轉錄組水平的解析可為臨床實踐提供有價值的參考信息。分析多灶HCC的RNA表達譜，一方面可以開發潛在的治療靶點，另一方面也有助于預測術后腫瘤進展或復發[31]。

不同起源模式的多灶HCC有著不同的免疫微環境特征。Dong等[4]發現IM-HCC 病灶中T淋巴細胞浸潤減少，而M2型巨噬細胞浸潤增加。相比之下，在MO-HCC中免疫檢查點抑制性分子的表達更多。IM-HCC有更多共有的新生抗原和T淋巴細胞(抗原)受體庫，而MO-HCC則很少。此外，由于MO-HCC免疫浸潤較低，所以會發生更多的免疫編輯。筆者團隊發現多灶HCC中存在顯著的免疫異質性，體現在免疫分子表達水平上的差異，但有趣的是，CD8+T淋巴細胞富集結節中，細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4和PD-1、PD-L1等抑制性免疫分子的表達也同樣升高，使得浸潤的CD8+T淋巴細胞難以發揮抗腫瘤功能[23]，因此，對于CD8+T淋巴細胞高浸潤的患者，進行PD-1/PD-L1抑制劑治療可以緩解其免疫抑制狀態，從而增強浸潤CD8+T淋巴細胞的殺傷能力。此外，作者發現與同一多灶性HCC病例中的大癌灶相比，小癌灶具有更多的免疫細胞浸潤和免疫通路上調，這可能部分解釋了為何小癌灶和大癌灶在抗PD-1治療時反應不同[24]。

近期一項多灶HCC的研究將HCC分為3個亞型：免疫健全型、免疫缺陷型、免疫抑制型，不同的亞型中免疫細胞的組成差異較大，為將來的研究提供了很好的分類參考。免疫健全型具有正常的T淋巴細胞浸潤，但B淋巴細胞浸潤少；免疫缺陷型的淋巴細胞浸潤較少，但有較多的樹突狀細胞和自然殺傷細胞；免疫抑制型中調節性T淋巴細胞、調節性B淋巴細胞和M2型巨噬細胞較多，同時伴隨PD-1、PD-L1、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4以及Tim-1的表達上調[32]。此外，CD45和Foxp3可以作為簡單有效的免疫治療預測標志物，提示免疫異質性分析對指導免疫治療具有重要意義。

3 小結

綜上所述，針對多灶HCC患者進行不同或聯合的免疫治療時需要考慮多灶HCC免疫微環境的異質性[24,32]。采用免疫檢查點抑制劑單藥或聯合靶向藥物治療的個體化免疫治療策略是多灶HCC患者獲得更好臨床療效的重要環節。