HBV相關肝細胞癌的發生機制

顏永聰， 溫 凱， 毛 凱， 肖治宇， 王 捷

中山大學孫逸仙紀念醫院 肝膽外科， 廣州 510120

原發性肝癌是最常見的致死性腫瘤之一，在常見的腫瘤類型中位列第六，死亡率排名第二[1]。國際癌癥研究機構發布的《GLOBOCAN2018》報告稱，每年約有841 000例肝癌新發病例和782 000例肝癌死亡病例[2]。肝細胞癌(HCC，以下簡稱肝癌)占原發性肝癌的70%～90%[3]。我國肝癌的發病率和死亡率在腫瘤中分別位居第四位和第三位[4-5]，嚴重威脅我國人民群眾的生命健康。目前廣泛認為肝癌的發生發展與多種危險因素密切相關，包括肝炎病毒感染、黃曲霉素、酒精濫用和肝臟自身代謝的異常等[6]。HBV感染是肝癌的主要危險因素，特別是在東亞和撒哈拉以南非洲地區，其危險性明顯高于HCV感染、黃曲霉毒素污染的食品、大量飲酒、肥胖、吸煙和2型糖尿病[3]。在全球范圍內，約有20億人感染HBV，超過3.5億人已成為慢性攜帶者[7]。盡管我國推廣針對HBV的免疫規劃，病毒性肝炎的新發病例數量在顯著下降，但是慢性乙型肝炎仍影響著將近9000萬人，是肝癌的主要病因，并且與肝癌的惡性進展、術后復發轉移密切相關[8]。鑒于HBV感染引發的肝癌在所有肝癌病例中占比大，而且HBV參與肝癌的發生發展有其特殊的病理過程，相應的診療策略存在不同，所以HBV感染引發的肝癌有別于其他病因導致的肝癌，可以看作是肝臟的一種特殊的腫瘤，被稱為HBV相關肝癌(HBV-HCC)。

HBV-HCC發病機制錯綜復雜[9]。本文在近年來相關文獻的基礎上，歸納總結HBV-HCC發生發展過程中的重要因素，包括HBV X蛋白(HBx)、免疫失衡以及病毒DNA整合等，同時結合本課題組的研究方向及成果，著重敘述HBx與細胞增殖、侵襲、轉移、血管生成和凋亡的關系及其在HBV-HCC中的作用及機制，以期對HBV-HCC的防治工作帶來新的思考。

1 HBV基因組結構和HBV-HCC的發生發展機制

HBV屬于嗜肝病毒科，是一種部分雙鏈環狀DNA病毒。它的基因組包含四個重疊的開放閱讀框，編碼四種蛋白質，分別為pre-S/S(病毒表面蛋白)、C(病毒核心蛋白)、P(病毒聚合酶)和X (HBx蛋白)[10-11]。

HBV通常是通過HBx、免疫失衡以及病毒DNA整合入宿主基因組從而參與肝癌的發生發展。(1)HBx是一種由HBV編碼的癌蛋白，研究[12-13]表明HBx可以作為癌基因或輔助因子，通過改變細胞的正常生理機制促進肝癌的發生發展；(2) HBV感染宿主后由免疫系統激活誘導T淋巴細胞攻擊被HBV感染的肝細胞，肝細胞壞死后引起炎癥，通過激活成纖維細胞導致肝纖維化進而導致肝硬化。此外由HBV感染導致的免疫反應可引發氧化應激反應并產生活性氧(ROS)，對DNA造成氧化損傷，DNA損傷的累積會進一步導致肝癌的進展[14]；(3)在85%～90%的HBV-HCC病例中，HBV基因組會整合到宿主基因組中，經過整合的基因還有進一步發生突變的可能，而這些會導致宿主基因組的不穩定以及各種細胞內信號傳導途徑的紊亂，進而促進肝癌的進展[15-16]。

2 HBx與HBV-HCC

HBx由HBV基因組的第四個開放閱讀框編碼，由145～154個氨基酸構成，是一種分子量為17 kD的多功能蛋白質，主要存在于HBV陽性肝細胞的細胞核中，細胞質中也有一定的累積，在HBV-HCC患者的腫瘤中經常被檢測到，目前研究認為HBx是HBV感染致癌的重要因素，雖然不能結合于宿主細胞DNA序列上，但可通過與多種轉錄因子作用、反式轉錄激活、蛋白相互作用、改變DNA甲基化狀態、翻譯后修飾等多種形式影響細胞周期和細胞轉化等關鍵信號轉導通路，最終促進肝癌的發生與發展[17-18]。在這里，作者將結合近年來現有的研究，從以下不同角度闡明HBx在肝癌發生發展中的作用和相關機制。

2.1 HBx與細胞增殖 HBx可通過調控非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)促進肝癌細胞增殖。ncRNA主要包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和microRNA(miRNA)。盡管ncRNA不能編碼蛋白質，但是越來越多的證據表明它們在細胞增殖、細胞周期控制、抗凋亡、上皮-間質轉化、腫瘤浸潤和轉移中具有多種重要的生物學功能。

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的ncRNA，其通過基因調控在遺傳、轉錄或轉錄后水平上參與多種人類疾病的發生發展。最近的研究表明，HBx通過調控lncRNA促進肝癌細胞增殖在癌變過程中起關鍵作用。本團隊報道了一種同時受HBx和SMYD3調控的新型lncRNA，并將其命名為lncIHS(HBx芯片與SMYD3芯片之間的lncRNA交集)，發現lncIHS在細胞質和細胞核中均有分布，主要位于細胞核中。lncIHS可能通過激活ERK和AKT信號傳導及其下游分子(例如c-Myc，Cyclin D1和EMT相關基因)進而促進肝癌細胞遷移，侵襲和增殖；與癌旁組織相比，肝癌組織中lncIHS表達顯著增加(P<0.01)；肝癌中lncIHS的高表達與HBV感染(P=0.002)、腫瘤較大(P=0.018)、門靜脈侵犯(P=0.003)和TNM高分期 (P=0.002)相關。此外，具有高lncIHS表達的肝癌患者的總體生存期和無病生存期較短(P值均<0.01)；所以lncIHS可能是肝癌預后的候選生物標志物和潛在的治療靶點[19]。在Yu等[20]的研究中發現lncRNA-6195通過抑制ENO1的酶活性抑制肝癌的生長，而在HBV-HCC中HBx通過下調lncRNA-6195的表達促進肝癌的進展。

miRNA是一種21～23個核苷酸的RNA分子，可以調節靶mRNA的穩定性或翻譯效率。miRNA在腫瘤生物學的幾乎所有方面都具有作用，例如增殖、凋亡、侵襲/轉移和血管生成等。HBx可通過調控miRNA促進肝癌細胞增殖。在本團隊早期的研究中，發現HBx在體外改變了肝癌細胞中miRNA表達譜，包括對miRNA-16家族的抑制。此外HBx介導的HepG2細胞中miRNA-15a/16的下調是通過c-Myc介導的，而體外表達的miRNA-15a/16通過誘導細胞周期阻滯和凋亡抑制HepG2-hbx細胞的增殖、克隆原性和不依賴于貼壁的生長[21]。此外，其他團隊的多項研究[22-33]表明，HBx通過下調miRNA-18b、miRNA-137、miRNA-548p、miRNA-1236、miRNA-329、miRNA-124以及上調miRNA-135b、miRNA-539、miRNA-3928v、miRNA-5188、miRNA-155、miRNA-520e和miRNA-181b促進肝癌細胞增殖。

2.2 HBx與細胞的侵襲和轉移 HBx通過多種機制促進肝癌的侵襲和轉移。比如，Liu等[34]的研究表明HBx刺激NF-κB信號傳導并增加血管內皮生長因子(VEGF)和基質金屬蛋白酶的表達，后者進而促進肝癌細胞的侵襲和轉移。Han等[35]研究發現HBx與過氧化物酶體的特定分布可能通過增加細胞ROS水平從而增加肝癌細胞的侵襲能力。除此之外， lncRNA和miRNA在HBx促進肝癌細胞侵襲轉移中同樣發揮著重要作用。本團隊的研究[36]發現lncRNA WEE2-AS1在肝癌組織中過表達，尤其是在HBV陽性肝癌組織中明顯上調，Western Blot分析進一步證實WEE2-AS1可以上調FERMT3并激活PI3K/AKT/GSK3b信號通路，進而促進肝癌細胞的侵襲與轉移。另外還發現了一個新的lncRNA LINC01352，它在HBV/HBx陽性肝癌組織和細胞中顯著下調，作為腫瘤抑制基因參與HBx誘導的HBV-HCC進展，進一步的實驗發現HBx/ERα復合物通過調控LINC01352-miRNA-135b-APC軸參與肝癌進展的過程[27]。在Liang等[37]的研究中發現，肝癌細胞中lncRNA-SOX2OT的上調可能導致肝癌微環境中PKM2含量升高，從而激活糖酵解途徑，最終促進腫瘤的發生和轉移，而miRNA-122-5p的表達可以抑制lncRNA-SOX2OT的表達。Xie等[38]的研究表明，miRNA-6875-3p表達升高，并可通過BTG2/FAK/Akt途徑促進肝癌的增殖、侵襲和轉移。Zhao等[39]研究發現，miRNA-26a通過抑制PTEN促進肝癌的侵襲/轉移，并通過抑制肝癌中的EZH2抑制細胞增殖。

2.3 HBx與血管形成 眾所周知，肝癌是一種高度血管化的實體瘤，血管生成對于肝癌的生長和轉移非常重要。實際上，血管生成是血管生長和成熟的驅動因子之間失衡的結果，包括VEGF-A、B、C、和D,成纖維細胞生長因子，血小板源生長因子，血管生成素，肝細胞生長因子，內皮素(CD105)和其他因子等。缺氧被認為是刺激腫瘤血管生成的強烈因素[40-41]。目前，大多數研究肝癌低氧介導機制的體外和體內肝癌模型關注低氧誘導因子蛋白的上調，其誘導促血管生成因子表達上調，后者可通過MAPK和PI3K/Akt/mTOR途徑激活內皮細胞酪氨酸激酶和隨后的細胞內信號傳導，進而導致肝癌腫瘤血管生成[42]。據報道[43-44]，HBx可上調缺氧誘導因子-1α的穩定性和轉錄活性以及VEGF和血管生成素2的表達，從而促進血管生成。

2.4 HBx與細胞凋亡 HBx誘導的肝癌相關細胞凋亡可通過激活多個胞內信號通路包括p53通路、MAPK通路等實現的。轉錄調節因子p53是一種抑癌基因,其主要功能是監測DNA復制和細胞分裂，阻斷細胞周期進程并誘導凋亡以維持基因組完整性，當細胞受到內源性或外源性刺激時，由抑癌基因p53及其下游靶基因包括p21CIP/WAF1、Bax、TGFα、EGFR組成的p53途徑被激活，p21CIP/WAF1抑制可誘導pRb磷酸化的cyclin-CDK復合物，隨后阻止E2F1的釋放，導致細胞周期停滯在G1期，最終誘導細胞凋亡[45]。p53與HBx之間的相互作用已被廣泛證實，在轉錄水平上，HBx可以抑制p53啟動子活性，并顯著下調HBx轉染細胞中p53的mRNA水平；在蛋白質水平上，HBx可直接與p53相互作用并抑制p53功能，這可能對早期肝癌的發生至關重要。有研究[46-49]表明，HBx可抑制p53、TGFβ、Fas和TNF誘導的細胞凋亡，下調Wnt/catenin的表達；或通過p38/MAPK途徑和SATB1蛋白激活HURP的表達，導致抗凋亡蛋白積聚，最終抑制肝癌細胞凋亡。

對于無法手術或已經遠處轉移的肝癌患者，索拉非尼是目前的一線治療藥物。然而在索拉非尼的臨床應用中，出現了獲得性耐藥的現象，尤其是在HBV-HCC中，其耐藥機制目前仍未清楚。本團隊研究發現HBV感染可通過調控miRNA-193b及其下游靶蛋白Mcl-1促進肝癌細胞對于索拉非尼的耐藥；過表達miRNA-193b能夠促進索拉非尼介導的肝癌細胞凋亡，改善耐藥現象[50]。另外作者首次提出HBx通過細胞內聚積，可以上調P-Raf和P-Erk的活性，激活MAPK通路，參與Bortezomib在HBV相關肝癌中的靶向耐藥。進一步發現，PD98059可以拮抗HBx誘導的Bortezomib耐藥，且兩者聯合應用在HBV-HCC中具有協同效應。Bortezomib作為第一個臨床應用的蛋白酶體抑制劑，PD98059作為一種MEK抑制劑，與其他已批準上市或正處于臨床試驗中具有MAPK通路抑制效果的藥物(如索拉非尼等)聯用，在HBV-HCC中也可能發揮協同作用[51]。

2.5 HBx與代謝 近年來，有關代謝重組機制的研究為解釋HBV-HCC的發生發展提供了新的視角。既往研究提示HBx可影響肝細胞脂質代謝。Kim等[52]首次報道了HBx過表達可通過激活固醇調節元件結合蛋白1和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)的轉錄水平，進而導致肝細胞脂肪變性。Na等[53]進一步揭示了HBx聯合肝X受體促進肝細胞脂肪變性從而導致HBV-HCC發生的分子機制。最近研究[54]顯示，HBx通過抑制miRNA-384使得促癌因子多效生長因子的表達上調，后者通過增加固醇調節元件結合蛋白-1c和脂肪酸合酶的合成引起肝脂質代謝異常，進而促進肝癌發生。HBx還可通過激活P2X-Akt途徑導致肝異常脂質代謝異常，而降脂藥阿伐他汀可抑制這一現象，并抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力[55]。在糖代謝方面，HBx可通過激活轉錄因子Nrf2,上調葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的表達水平，改變肝的正常糖代謝過程[56]。最新研究[57]發現，HBx通過BNIP3L介導的線粒體自噬，重組糖酵解代謝過程，導致肝癌細胞干性增加。 除此之外，HBx還可通過lncRNA H19/miRNA-675/PPARα軸重組肝細胞損傷及能量代謝過程[58]。 總的來說，HBx通過代謝信號通路的調節對肝細胞代謝過程進行重組，為HBV復制提供所需要的脂質、蛋白質、核苷酸和能量，進而促進了HBV相關的癌變進程。

3 免疫失衡與HBV-HCC

肝臟，實際上可被視為一個“一線免疫器官”，含有大量先天性和適應性免疫細胞，包括巨噬細胞、自然殺傷細胞、自然殺傷性T淋巴細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞等，它們可檢測、捕獲和清除病原體、招募白細胞、呈遞抗原并啟動免疫應答反應，在宿主防御、維持免疫穩態中起著重要的作用[59]。免疫激活和免疫耐受之間的平衡至關重要，在人類慢性HBV感染過程中，肝損傷并不是由病毒直接引起的，而是由試圖清除病毒的免疫反應所致，肝臟免疫狀態從免疫耐受逐漸轉變為免疫激活、失活、再激活，最終發生免疫衰竭，這可能是導致肝癌發生的免疫致病因素[60]。

數據顯示，90%的HCC發生與肝損傷及炎癥有關，因此HBV-HCC被普遍認為是炎癥相關腫瘤，這種炎癥實際上是由肝臟中長期存在的HBV持續招募免疫細胞而建立起來的慢性低水平炎癥狀態。HBV感染使得單核細胞及原髓細胞在肝組織中浸潤活化，產生IL-6、TNFα、IL-1β、IL-18等促炎因子[61-66]，并通過NF-κB、STAT3、Wnt/β-catenin等多個信號通路，影響ROS的產生，干擾正常的免疫調節機制，介導免疫逃逸形成[67-70]；同時還產生抗炎反應(TGFβ、IL-10等)以抑制過度的炎癥損傷，干擾正常的損傷修復過程，最終導致肝纖維化、肝硬化及HCC的發生[71]。

4 HBV DNA整合與HBV-HCC

HBV DNA整合入宿主基因組被認為是導致HBV-HCC發生發展的重要因素，然而其具體機制尚未完全明了[72]。一項針對1115個HBV整合位點的研究[73]發現，HBV容易整合在外顯子、內含子、啟動子以及基因密集區域，進一步的功能注釋分析顯示，與鄰近非腫瘤組織相比，HCC腫瘤組織中的整合靶向宿主基因在與細胞死亡負調控、轉錄調控、發育分化及腫瘤相關通路相關的功能方面顯著富集。Zhao等[74]采集426例HCC患者的腫瘤組織及癌旁組織，借助高通量病毒整合檢測和RNA測序分析識別出4225個HBV整合事件，發現HBV容易整合到罕見的脆弱位點和功能基因組區域，HBV在腫瘤組織和癌旁組織的優先整合位點不一樣，HBV插入位點在腫瘤端粒附近顯著富集，具有男性及肝硬化依賴模式，最終驅動致癌轉化。而新近一則研究[75]發現，70%HBsAg陰性的HCC患者存在隱匿性HBV感染，其中69%患者的HBV DNA與肝細胞DNA融合，而這些患者中90%沒有肝硬化，此外，HBV DNA整合主要發生在肝癌相關基因附近，如端粒酶逆轉錄酶基因、賴氨酸甲基轉移酶2B基因和細胞周期蛋白A2基因，提示HBV基因整合可能是導致血清學陰性且無肝硬化背景的患者發生肝癌的重要機制，因此對于HBV感染消退、HBsAg缺失的患者，臨床上建議仍應檢測其肝組織中的HBV DNA，以確定是否存在發生HCC的風險。

5 結論

HBV-HCC的發生發展是一個多分子參與、多信號通路交織作用和多步驟的過程，涉及HBV蛋白HBx、免疫失衡以及病毒DNA整合入宿主基因組等機制，其中，重點闡述了HBx在HBV-HCC發生發展中的各種惡性生物學功能，包括調節細胞增殖、侵襲、轉移、血管生成和凋亡以及相關分子機制等。未來方向應進一步深化探索HBV-HCC發生發展的具體分子事件及作用機制，為發現新型治療靶點提供新的思路及堅實的理論依據。