下調(diào)miRNA-221對肝癌生物學(xué)行為的影響*

韓雙喜 王 麗 王介營 王玉虎 王海南 李傳光 徐 萌 成良棟

山東省濱州市中心醫(yī)院肝膽外科，山東省惠民縣 251700

miRNA是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈RNA，長度20～23個(gè)核苷酸[1]。與正常組織來源細(xì)胞中的miRNA相比，大多數(shù)腫瘤組織中miRNA存在明顯的表達(dá)差異，包括表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)，因此，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)， miRNA-221在原發(fā)性肝癌中呈高表達(dá)[3]，但其對肝癌調(diào)控作用尚不明確。本研究通過下調(diào)miRNA-221的表達(dá)，研究其對肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞株HepG2受贈(zèng)于濱州醫(yī)學(xué)院；干擾序列、pHelper 1.0、pHelper2.0、引物和pGCSIL-GFP等由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司合成；限制性內(nèi)切酶(NEB公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建慢病毒載體：首先依據(jù)能有效干擾人miRNA-221基因表達(dá)的靶序列制成雙鏈DNA。然后其與pGCsil-GFP載體連接并轉(zhuǎn)化。再通過PCR法篩選出陽性克隆，提取出質(zhì)粒，然后再進(jìn)行酶切并測序。再將pHelper1.0、pHelper2.0和重組慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得僅攜帶綠色熒光蛋白基因的重組慢病毒NC-GFP-LV，以及攜帶下調(diào)miRNA-221基因表達(dá)的重組慢病毒miRNA-221-RNAi-LV。采用逐孔稀釋法測定病毒的滴度。

1.2.2 測定病毒感染效率及HepG2細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染：采用0～20不同感染梯度的病毒感染HepG2細(xì)胞，病毒在無血清培養(yǎng)基中感染HepG2細(xì)胞2h后，加入10%牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3d后，流式細(xì)胞儀檢測GFP的陽性表達(dá)率，確定感染效率。將HepG2細(xì)胞分為3組：(1)實(shí)驗(yàn)組(miRNA-221-siRNA，SI組)，即轉(zhuǎn)染攜帶下調(diào)miRNA-221基因表達(dá)的重組慢病毒。(2)陰性對照組(negative control，NC組)，即進(jìn)行轉(zhuǎn)染但未攜帶慢病毒。(3)正常組(normal，N組)。

1.2.3 RT-PCR檢測：轉(zhuǎn)染72h后開始收集HepG2細(xì)胞， miRNA-221的目的基因PTEN的表達(dá)情況通過RT-PCR檢測，通過PTEN的表達(dá)情況來判斷干擾效果；同時(shí)檢測促凋亡基因Caspase 3的表達(dá)情況。β-actin上游引物：5-CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3，下游引物5-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3，擴(kuò)增條帶為101bp；PTEN的上游引物為：5-CGGCAGCATCAAATGTTTCAG-3，PTEN的下游引物為：5-AACTGGCAG GTAGAAGGCAACTC-3，擴(kuò)增條帶為235bp；Caspase 3的上游引物：5-GTGGTACAGAACTGGACTGTGGC-3，下游引物：5-GTTGCCACCTTTCGGTTAACCCG-3，擴(kuò)增條帶為244bp。PTEN/β-actin和Caspase 3/β-actin吸光度比值分別表示PTEN mRNA和Caspase 3 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.4 MTT比色法測定吸光度：將細(xì)胞每孔3×103個(gè)接種于96孔板中，每組接種10孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行慢病毒的轉(zhuǎn)染，分別于24h、48h、72h、96h向每孔加入MTT 20μl(0.5mg/ml)，37℃孵育4h，然后丟棄MTT液，再加入150μl的DMSO，然后混合均勻，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔490nm光吸收值，重復(fù)檢測3次。比較各組HepG2細(xì)胞的生長情況。

1.2.5 transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)：選用孔徑為8μm的24孔Borden小室，上室加入1×105個(gè)細(xì)胞，總體積200μl，下室加入300μl含血清培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48h后取出小室，甲醇固定并Giemsa染色10min，去除上層小室側(cè)的未遷移細(xì)胞，觀察到達(dá)遷移杯底下面的細(xì)胞。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍攝(×100倍)，計(jì)算每個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 Hochest33258熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡：首先將培養(yǎng)的細(xì)胞制成單細(xì)胞片, 然后應(yīng)用4%多聚甲醛在室溫下固定10min，再用PBS液洗滌2次,加入Hoechst33258均勻覆蓋單細(xì)胞片，染色15min，再用PBS液清洗單細(xì)胞片3次,封片后在熒光顯微鏡下觀察。正常細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核則表現(xiàn)為濃染致密或斷裂的顆粒塊狀熒光。隨機(jī)于100倍熒光顯微鏡下照相。

1.2.7 荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的建立：將裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(SI組)、陰性對照組(NC組),每組5只，HepG2細(xì)胞懸液200μl于每只裸鼠背部皮下注射。采用瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射的方法，定時(shí)分組分別注射miRNA-221-RNAi-LV和空病毒NC-GFP-LV。每隔3d注射1次，每次病毒量為2×107個(gè)/只，共注射6次。之后每天觀察腫瘤生長情況,每隔3d測量腫瘤的長、短徑,計(jì)算腫瘤的體積。腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2。繪制移植瘤生長曲線。于最后1次注射藥物后3d頸椎脫臼法處死裸鼠,切取腫瘤組織標(biāo)本。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-221-RNAi-LV的構(gòu)建及病毒滴度測定 miRNA-221基因干擾的重組細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為270bp,鑒定結(jié)果與預(yù)期一致，測序結(jié)果表明,合成的miRNA-221的siRNA核苷酸序列插入正確,沒有堿基缺失或替換。病毒滴度:miRNA-221-siRNA-LV和NC-GFP-LV均為2×109TU/ml。

2.2 病毒感染效率及干擾情況 采用(MOI=0～20)不同梯度的病毒感染HepG2細(xì)胞，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果顯示，MOI=0～20的不同感染梯度對HepG2細(xì)胞感染效率分別為0.38%(MOI=0)、22.37%(MOI=5)、73.06%(MOI=15)及95.10% (MOI=20)，MOI=20的感染滴度對HepG2細(xì)胞感染效率較高(95.10%)，見圖1。轉(zhuǎn)染72h后，PTEN的mRNA表達(dá)水平N組(0.034±0.001)、NC組(0.037±0.003)與SI組(0.123±0.005)相比較，SI組miRNA-221的靶基因PTEN表達(dá)增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 流式細(xì)胞檢測GFP的表達(dá)率

2.3 MTT比色法測定miRNA-221-RNAi-LV對HepG2細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染后24h，檢測SI組的吸光度值開始下降，表明SI組的HepG2細(xì)胞增殖減弱，在之后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，均表現(xiàn)為吸光度值降低。

圖2 PTEN mRNA表達(dá)的灰度值

在96h NC組(1.070±0.020)和N組細(xì)胞(1.070±0.015)與SI組(1.030±0.023)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這個(gè)結(jié)果表明下調(diào)miRNA-221的表達(dá)可以抑制HepG2細(xì)胞的增殖能力。

2.4 transwell體外遷移實(shí)驗(yàn) 經(jīng)transwell小室培養(yǎng)模型培養(yǎng)后，對三組的穿膜細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，NC組的遷移細(xì)胞數(shù)(43±4)、N組的遷移細(xì)胞數(shù)(45±4.1)和SI組的遷移細(xì)胞數(shù)(31±5.5)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而NC和N組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 miRNA-221-RNAi-LV對HepG2細(xì)胞增殖的影響

2.5 下調(diào)miRNA-221的表達(dá)對HepG2細(xì)胞凋亡的影響 熒光染色后,于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,凋亡的HepG2細(xì)胞發(fā)生核固縮,表現(xiàn)為濃染致密的顆粒塊狀熒光。SI組HepG2細(xì)胞增殖減弱，凋亡增加，熒光顯微鏡下觀察可見較多的顆粒狀熒光，這表明下調(diào)miRNA-221可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡。

2.6 RT-PCR檢測促凋亡基因Caspase 3變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示促凋亡基因Caspase 3的mRNA表達(dá)水平分別為N組(0.027±0.004)、NC組(0.029±0.003)和SI組(0.072±0.001)，三組相比較，SI組的Caspase 3表達(dá)增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 Caspase 3 mRNA表達(dá)的灰度值

2.7 miRNA-221-RNAi-LV對裸鼠移植瘤的抑制作用 通過腫瘤長短徑計(jì)算移植瘤體積，移植瘤的生長曲線如圖4所示，在注射HepG2細(xì)胞懸液3d后，SI組的移植瘤開始出現(xiàn)生長抑制表現(xiàn)，與NC組相比生長速度變慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032 0，P<0.05)。

圖4 裸鼠移植瘤的生長曲線

3 討論

miRNAs通過與靶基因3’UTR結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)[4]，這是最近研究的熱點(diǎn)問題。目前在人類已發(fā)現(xiàn)700 多種miRNAs，這些miRNAs可以影響正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡等一系列病理生理過程[5-6]。但大多數(shù)miRNAs 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。在腫瘤中過表達(dá)的miRNAs被認(rèn)為是癌基因，但是目前的研究也發(fā)現(xiàn)部分miRNAs在腫瘤中表達(dá)是下調(diào)的，如果其功能缺失或減弱就有導(dǎo)致正常的細(xì)胞發(fā)生惡變之可能，這類miRNAs被認(rèn)為是抑癌基因。在某些腫瘤中，某些miRNAs的表達(dá)出現(xiàn)異常，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-221在腫瘤組織中異常表達(dá)，其中在甲狀腺乳頭狀癌[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9-12]、肝細(xì)胞癌[13-14]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、結(jié)直腸癌[15-16]等多種腫瘤中存在過表達(dá)，而在前列腺癌和胃腸道間質(zhì)瘤[17]等多種腫瘤組織中存在低表達(dá)。此外， miRNA-221在乳頭狀甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、腎細(xì)胞癌等腫瘤患者的血清或血漿中過表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將miRNA-221-RNAi-LV轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞而導(dǎo)致PTEN基因表達(dá)上調(diào)，說明miRNA-221-RNAi-LV發(fā)揮下調(diào)miRNA-221作用顯著。下調(diào)HepG2細(xì)胞的miRNA-221后，通過調(diào)節(jié)PTEN等信號通路而使HepG2細(xì)胞生長受到抑制、遷移能力減弱。miRNA-221的表達(dá)下調(diào)后肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡增加，同時(shí)檢測到Caspase 3的表達(dá)上調(diào)，這表明miRNA-221表達(dá)下調(diào)后促進(jìn)Caspase 3的過表達(dá)是miRNA-221促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。這也提示miRNA-221在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起癌基因的作用。

不同的研究對肝癌細(xì)胞的凋亡與miRNA-22l之間潛在關(guān)系有不同的研究結(jié)果。Dai等[18]的研究發(fā)現(xiàn)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程中，miRNA-22l模擬物促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，而miRNA-221阻遏物的作用恰恰相反。但Gramantieri等[19]則發(fā)現(xiàn)敲低miRNA-22l后，可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞SNU449的凋亡，同時(shí)該研究也發(fā)現(xiàn)與凋亡相關(guān)的Bmf也是miRNA-22l的分子靶標(biāo)，這也表明通過影響蛋白的表達(dá)而抑制細(xì)胞的凋亡，這可能是miRNA-22l作用機(jī)制之一。

Pineau等的研究將MSCV-miRNA-221轉(zhuǎn)染入小鼠肝祖細(xì)胞中，建立肝癌小鼠模型。其研究結(jié)果顯示，與對照組相比，腫瘤發(fā)生發(fā)展的速度明顯增快，這個(gè)研究結(jié)果也表明miRNA-221可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[20]。本文研究結(jié)果表明，miRNA-221表達(dá)下調(diào)后HepG2細(xì)胞的凋亡增加。有研究證實(shí)，miRNA-221可以活化AKT，其機(jī)制是miRNA-221與 PTEN基因的3’UTR區(qū)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，使其表達(dá)下調(diào)，從而有效激活A(yù)KT[21]，其有效激活后可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等。AKT與PTEN作為體內(nèi)多個(gè)信號通路的關(guān)鍵因子， miRNA-221促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制就是激活PTEN/AKT信號通路。

有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-221的過表達(dá)可以影響腫瘤細(xì)胞對替莫唑胺、順鉑等化療藥物的敏感性，從而影響化療效果。本研究中裸鼠移植瘤治療組與對照組的生長情況存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在臨床實(shí)踐中，因?yàn)轶w內(nèi)復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，單一的基因治療不一定能取得良好療效，所以下調(diào)miRNA-221的表達(dá)并聯(lián)合化療藥物或靶向藥物治療肝細(xì)胞肝癌，可能會(huì)取得更為有效的臨床效果。

綜上所述，miRNA-221-siRNA通過抑制miRNA-221的表達(dá)抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，降低其遷移能力。由于miRNA-22l在肝細(xì)胞癌中的過表達(dá)及與細(xì)胞增殖和凋亡密切關(guān)系，miRNA-221可以作為肝細(xì)胞癌基因治療的新靶點(diǎn)，下調(diào)miRNA-221的表達(dá)并聯(lián)合化療藥物或靶向藥物治療肝細(xì)胞癌，可能會(huì)取得更為有效的臨床效果。