某養(yǎng)殖場(chǎng)的病死野豬ASFV實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

楊嫻娟 ，吳永輝 ，楊嫻婧

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733006；3.哈密市伊州區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆 哈密 839000）

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種以高熱、皮膚和內(nèi)臟器官出血、高病死率為主要特征的急性、熱性、高度致死性傳染病[1]。由于該種病毒性疾病最初發(fā)生于非洲肯尼亞，因此被稱(chēng)為非洲豬瘟。該病在OIE中被列為A類(lèi)動(dòng)物傳染病，我國(guó)原農(nóng)業(yè)部在2008年發(fā)布的《一、二、三類(lèi)動(dòng)物疫病病種名錄》中也將其列入了一類(lèi)動(dòng)物疫病，是我國(guó)重點(diǎn)防范的外來(lái)動(dòng)物疫病之一[2]。目前，全世界尚缺乏有效的疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，各國(guó)防疫部門(mén)對(duì)于該病面臨著巨大的防控壓力。

據(jù)報(bào)道，全球已經(jīng)有60多個(gè)國(guó)家報(bào)道過(guò)非洲豬瘟疫情，我國(guó)首次報(bào)告的非洲豬瘟疫情發(fā)生于2018年8月的遼寧沈陽(yáng)，病情迅速向各個(gè)省份傳播蔓延，已經(jīng)給我國(guó)整個(gè)生豬行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2020年3月，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所報(bào)道了1株人工缺失7個(gè)基因的非洲豬瘟弱毒活疫苗對(duì)家豬具有良好的安全性和有效性[3]，但目前仍未見(jiàn)規(guī)模生產(chǎn)上市。因此，在疫苗研發(fā)上市之前，采用先進(jìn)、高效的檢測(cè)方法對(duì)非洲豬瘟病毒(ASFV)持續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)很有必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本

采用隨機(jī)抽樣的方式采集武威市某野豬養(yǎng)殖場(chǎng)病死豬耳朵（每份血樣20～40 mL）和鼻拭子樣品各2份，帶回實(shí)驗(yàn)室，置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２杉臉颖揪敿?xì)記錄樣本來(lái)源、豬群階段等信息。

1.1.2 試劑與儀器

DNA/RNA提取試劑盒和非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自洛陽(yáng)萊普生信息科技有限公司 。

試驗(yàn)所需移液槍、超凈工作臺(tái)，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)等均由武威市牛滿(mǎn)加藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

隨機(jī)分別從每份豬耳朵的3個(gè)不同位置稱(chēng)取少量組織樣品（1 g），立刻用手術(shù)剪剪碎混勻后稱(chēng)取0.05 g于研缽中研磨，加入1.5 mL的生理鹽水后繼續(xù)研磨。待勻漿后轉(zhuǎn)入1.5 mL無(wú)菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，取上清至1.5 mL無(wú)菌離心管中。

每份鼻拭子樣品浸液置于4 ℃冰箱過(guò)夜，在旋渦振蕩器上震蕩5 s，用移液器將鼻拭子浸液全部移入1.5 mL無(wú)菌離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上清至1.5 mL無(wú)菌離心管中。

以上樣品均置于60 ℃條件下滅活30 min，轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取和qPCR實(shí)驗(yàn)

分別參照DNA/RNA提取試劑盒和非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

qPCR反應(yīng)體系：20 uL；qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，循環(huán)95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共 40 個(gè)循環(huán)，在循環(huán)第二階段結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。

2 結(jié)果判定

2.1 結(jié)果有效性

2.1.1 試劑盒有效性判定

陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，呈典型的S型曲線(xiàn)；陰性對(duì)照Ct值＞38或無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，則實(shí)驗(yàn)成立。

2.1.2 樣品結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，表明樣本中檢測(cè)出ASFV；

疑似：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38之間，應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢，如實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38之間，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，則判定為陽(yáng)性，否則判定為陰性；

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值，表明樣本中無(wú)ASFV，對(duì)于某些未呈S型曲線(xiàn)，但本底較高的樣品，亦判定為陰性。

2.2 結(jié)果

2.2.1 試劑盒檢測(cè)結(jié)果

由表1和圖1可知，2份陽(yáng)性對(duì)照的Ct值分別為22.973和22.785，均小于30；熒光值均呈指數(shù)增長(zhǎng)，形成典型的S型曲線(xiàn)。2份陰性對(duì)照均無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。

2.2.2 樣本檢測(cè)結(jié)果

由表1和圖1可知，豬耳樣品和豬鼻拭子樣品均無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)，表明實(shí)驗(yàn)中所有被檢測(cè)樣品均為ASFV 抗原陰性。

3 討論

目前，全世界范圍尚未研制出有效的ASFV疫苗，在非免疫狀態(tài)下，使用靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)對(duì)ASFV進(jìn)行檢測(cè)，是目前非洲豬瘟防控最有效的辦法之一。本實(shí)驗(yàn)選取臨床及病理特征與非洲豬瘟相似的2份野豬耳朵病料和2份野豬鼻拭子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)ASFV陽(yáng)性病例，說(shuō)明武威市非洲豬瘟防控措施基本到位，未出現(xiàn)缺口。

非洲豬瘟屬于外來(lái)病，邊境地區(qū)、生豬養(yǎng)殖貿(mào)易、調(diào)運(yùn)活躍區(qū)是重點(diǎn)防范地區(qū)。本研究針對(duì)甘肅省2020年5月分別發(fā)生非洲豬瘟疫情（分別在隴南市和蘭州市）的嚴(yán)峻防控形勢(shì)，本著對(duì)畜產(chǎn)品安全和人民生命財(cái)產(chǎn)安全負(fù)責(zé)的態(tài)度，對(duì)發(fā)生的任何有相關(guān)癥狀的病料進(jìn)行極速檢測(cè)，這與王惜婧[4]對(duì)非洲豬瘟疫情的防控對(duì)策相一致，石麗娟[5]在《探析非洲豬瘟及防控措施》一文中也提出了類(lèi)似建議。為進(jìn)一步加強(qiáng)甘肅省非洲豬瘟防控措施，擴(kuò)大監(jiān)測(cè)面，下一步研究中，取樣將進(jìn)一步擴(kuò)大范圍，增加與其他省市接壤鄉(xiāng)鎮(zhèn)的病死豬檢測(cè)力度。

表1 豬耳、豬鼻拭子樣品及陰陽(yáng)性對(duì)照Ct值

目前，尚無(wú)非洲豬瘟在威武市發(fā)生的報(bào)道，但周邊省市疫情形勢(shì)嚴(yán)峻，本研究在對(duì)某養(yǎng)殖場(chǎng)2頭不明原因病死野豬進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，為嚴(yán)防非洲豬瘟進(jìn)入威武市提供了重要的技術(shù)儲(chǔ)備，也為該病在威武市的防疫提供一些參考。