核酸檢測(cè)在豬病檢測(cè)中的常見問題與分析

孫華偉 ，郭 靜 ，張敬峰 ，李 彬 ，張小飛 ＊

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)診斷檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；2.安徽省定遠(yuǎn)縣畜牧獸醫(yī)局，安徽 滁州 233200）

核酸檢測(cè)依然是病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其病原學(xué)證據(jù)是無可替代和不容置疑的。在豬病的核酸檢測(cè)中，假陰性問題及豬群出現(xiàn)疑似感染卻遲遲檢測(cè)不到病原體的情況普遍存在，具體分析如下：

1 新病毒的確認(rèn)時(shí)間周期長(zhǎng)

自武漢暴發(fā)新型冠狀病毒肺炎以來，病毒這個(gè)專業(yè)術(shù)語迅速普及，可以說如今已成為家喻戶曉，婦孺皆知的日常用語了。但在20世紀(jì)之前，巴斯德、科赫等人提出的細(xì)菌致病學(xué)說占據(jù)主流，人們只知道傳染病皆由細(xì)菌或其毒素引起，并不知道“病毒”的存在。一個(gè)新病毒的出現(xiàn)，從分離到基因全序列測(cè)定、確認(rèn)需要較長(zhǎng)的時(shí)間周期，僅僅是發(fā)現(xiàn)第一個(gè)病毒，就花了41年的時(shí)間。部分豬病毒病的發(fā)現(xiàn)歷程見圖1。

較長(zhǎng)一段時(shí)間以來，江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)診斷檢測(cè)中心在接診的臨床病例中發(fā)現(xiàn)：豬群出現(xiàn)疑似病毒感染，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，常規(guī)的 ASFV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV等病毒核酸的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明這些豬群可能存在新的未知病毒，只是限于目前的檢測(cè)水平，尚不能確認(rèn)是何種病毒。

2 采集的待檢樣品不合格

根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的第七版新冠肺炎診療方案，從CoVID-19的樣品采集可以看出，樣品采集對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響很大，不少患者到第3次，甚至是第5次才出現(xiàn)陽性，后經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，樣品采集的日期或部位對(duì)檢測(cè)結(jié)果存在很大影響。同樣的道理，對(duì)豬群進(jìn)行血樣采集時(shí)，盡量采集發(fā)病后7 d內(nèi)的急性期抗凝血，而不是在豬群發(fā)病后2周才進(jìn)行血樣采集。采集內(nèi)臟組織時(shí)，盡量采集腫大的脾臟和腫大的淋巴結(jié)。

3 核酸提取效果差

3.1 選擇正規(guī)廠家的核酸提取試劑盒

江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)診斷檢測(cè)中心通過對(duì)多家核酸提取試劑盒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：不同試劑盒對(duì)核酸提取的效果差異顯著。在選擇不同廠家的試劑盒時(shí)，酶的活性、變性液的質(zhì)量、吸附柱的吸附效果及溶解液的溶解效率對(duì)樣品核酸物質(zhì)的提取效果影響很大。因此，在選擇核酸提取試劑盒時(shí)盡量先用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，而不能貪圖便宜，選擇質(zhì)量沒有保證的試劑盒。

3.2 使用核酸濃度分析儀

由于核酸在波長(zhǎng) 260 nm處有最高吸收峰，蛋白質(zhì)的吸收高峰在280 nm波長(zhǎng)處，因此，A260/A280是核酸純度的指示值。純度好的DNA或RNA，A260 / A280的比值應(yīng)該介于2.0～2.5。純凈的樣品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，說明提取的核酸純度較低，表示可能有鹽離子或者有機(jī)試劑污染[1]，需要純化樣品。見圖2和圖3。

江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)診斷檢測(cè)中心在使用不同廠家的試劑盒進(jìn)行核酸提取后發(fā)現(xiàn)：不同廠家試劑盒對(duì)同一樣品進(jìn)行核酸提取時(shí)，核酸提取效果差異很大，部分廠家的核酸提取試劑盒在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行核酸提取后，核酸濃度很低。建議實(shí)驗(yàn)室自行對(duì)不同的核酸提取試劑盒進(jìn)行比對(duì)分析，篩選出質(zhì)量穩(wěn)定、適合本實(shí)驗(yàn)室的核酸提取試劑盒。

4 小結(jié)

對(duì)于疫病診斷，最重要的是以最快速度做出明確診斷，這樣才能為后續(xù)的治療以及防控提供重要依據(jù)與基礎(chǔ)。通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，密切監(jiān)測(cè)病原體在豬群中的感染趨勢(shì)和帶毒量，對(duì)豬場(chǎng)快速、高效防控起到至關(guān)重要的作用。但實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是一個(gè)系統(tǒng)工程，絕非招聘幾個(gè)檢測(cè)人員、買幾臺(tái)儀器這么簡(jiǎn)單，因地制宜地制定樣品采集方案，操作規(guī)范，試劑盒質(zhì)量可靠，監(jiān)督環(huán)節(jié)不缺失等，是輸出合格檢測(cè)結(jié)果的重要保障。