白藜蘆醇對松遼黑豬精液冷凍的影響

菅芯蕊 ，張志彬 ，王 珺 ，張紹萱 ，于永生 ，羅曉彤 ，李兆華 ＊

（1. 吉林省農業科學院 畜牧科學分院，吉林 公主嶺 136100；2. 延邊大學農學院 畜牧學系，吉林 延吉 133002；3. 吉林大學動物科學學院，吉林 長春 130062）

現階段畜禽生產中，由于冷凍精液具有貯存時間長，可減少動物傳染病傳播，經濟效益高等優點，使得冷凍精液技術得到了快速發展，但是對于當前行業發展需求來說，豬冷凍精液的發展仍有很大的空間。氧化應激是影響解凍后豬精液品質下降的主要原因。冷凍精液解凍后精液中的氧化應激，主要是因為過量的活性氧（ROS）攻擊精子。過量的ROS主要引起精子的脂質過氧 化（lipid Peroxidation） 和 DNA片段化[1]。使精子畸形率上升，精子活率、精子運動速率等下降，最終導致受胎率、產仔率下降，流產率、胎兒畸形率上升。為了減弱ROS對精子的影響，研究人員嘗試加入抗氧化劑后，發現具有較好的效果。

X. G. Weng等[2]研究發現在凍存的公豬精液中添加黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）可以提高精子的抗氧化水平，改善體外受精（in vitro fertilization，IVF）參數和胚胎發育的結果。S. K.Baishya等[3]在冷凍基礎液中補充谷胱甘肽、維生素E和丁基化羥基甲苯，試驗后發現其可以顯著提高精子解凍后的活力，使精子頂體和質膜保持完整，脂質過氧化的發生率顯著降低。隨后S. K. Baishya等[4]在另一篇文章中指出，用含膽固醇的甲基-β-環糊精進行預冷凍處理，也可提高冷凍保存豬精液的質量。豬精子由于精子膜中不飽和脂肪酸含量多，對氧化應激特別敏感，某些豬精漿抗氧化劑會積極參與公豬精子耐冷耐受性，使低溫處理引起的氧化應激最小化。

白 藜 蘆 醇（resveratrol，Res）主要來自葡萄和毛葉藜蘆。它是一種天然抗氧化劑，一種植物防御素，對植物起保護作用，在植物遇到過量紫外線照射、真菌感染等不適宜條件下產生[5]。Res作為一種天然的非黃酮類多酚物質，近年來一直是科學研究的焦點，因為人們認為它對人類健康有積極影響[6]。Res的化學式為C12H14O3，分子量為 228.25，具有抗氧化、抗癌、降糖和抗衰老的活性[7]。Res的細胞防御機制是通過直接中和ROS或間接增強抗氧化酶的表達來抑制低密度脂蛋白（LDL）氧化維持細胞氧化還原平衡[8]?？寡趸瘎㏑es對精子發生有保護作用[9]。C. R. Lv 等[10]研究表明補充10 μM或50 μM濃度的Res可以改善解凍后山羊精子的質量，這可能是抑制ROS的產生所引起的。N. Abouzar等[11]研究表明添加40 μM白藜蘆醇的改良BTS（beltsville thawing solutjon）擴展劑可提高雞精子解凍質量。說明Res在精液冷凍保存中具有實用性。為了評價Res對豬凍融精子質量的影響，該研究將不同濃度的Res添加到冷凍基礎液中，對凍融精子的質量進行評價，以期為建立高效豬精液冷凍技術體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮豬精液來源于吉林省農業科學院畜牧科學分院原種豬場的松遼黑豬。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

BTS溶液：二水檸檬酸三鈉1.25 g，乙二胺四乙酸1.25 g，碳酸氫鈉1.25 g，青霉素鈉0.60 g，氯化鉀0.75 g，葡萄糖37.00 g，硫酸鏈霉素1.00 g在1 000 mL三蒸水中溶解， pH調節為7.2～ 7.4，滲透壓310 mOsm/L，4 ℃保存。

冷凍基礎液Ⅰ：乳糖35 g，葡萄糖25 g，青霉素鈉0.60 g，碳酸氫鈉1.25 g，硫酸鏈霉素1.00 g，卵黃200 mL溶于800 mL三蒸水中，調節pH為7.2～7.4，滲透壓317 mOsm/L，4 ℃保存。

冷凍基礎液Ⅱ：添加OEP和甘油，在冷凍基礎液Ⅰ的基礎上使OEP終濃度為0.50%（v/v），甘油終濃度為3.00%（v/v）。

果糖-檸檬酸鈉低滲溶液：二水檸檬酸鈉7.35 g，果糖13.51 g在1 000 mL三蒸水中溶解，滲透壓150 mOsm/L，4 ℃保存。

吖啶橙（acridine orange，AO）染液：AO 0.010 g，檸檬酸0.764 g，磷酸氫二鈉0.806 g溶于57.500 mL三蒸水中，現配現用。

2’，7’-二 氯 二 氫 熒 光 素二 乙 酸 酯（2’,7’-dichloro dihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）染液：DCFH-DA 0.50 g，用DMSO 102.61 mL溶解，分裝，避免反復凍存。

1.2.2 采集精液

采用手握采精法，佩戴滅菌手套，右手握公豬陰莖模仿母豬對公豬的刺激以誘導射精，左手拿著采精杯，杯子上覆蓋著精液過濾膜，舍棄開始的稀精部分，收集濃精部分。

1.2.3 精液冷凍

采集的精液用保溫箱裝好，于2 h之內送到實驗室。首先通過嗅覺和眼觀檢查，選擇帶腥味、乳白色的精液進行鏡檢，選擇活力在90%上，密度介于2.0億～4.0 億/mL的精液進行凍存前處理。

合格的精液等溫等體積加入BTS溶液稀釋，置于25 ℃恒溫箱1 h，期間不定時混勻精液，然后放入17 ℃恒溫箱平衡2 h，期間不定時混勻。平衡后的精液等體積分為5份，2 400 r/min，17 ℃下離心10 min，棄上清，沉淀備用，冷凍基礎液Ⅰ17 ℃預冷。然后分別加入沉淀中（0、25 μM、50 μM、100 μM、200 μM的Res分別加入冷凍基礎液Ⅰ中），重懸后4 ℃恒溫箱中平衡3 h。隨后加入等體積的冷凍基礎液Ⅱ，使精子終濃度為5×108個/mL，混勻后灌裝于0.5 mL細管中，封口。液氮熏蒸（上方3 cm處），熏蒸10 min，然后放入液氮中。在液氮罐中儲存1個月后檢測精液質量。

1.2.4 精液解凍

從液氮罐中取出待測樣品，50 ℃水浴鍋中孵育16 s（細管離開液氮不能超過8 s），轉移至37 ℃預熱的1.5 mL離心管中待檢，精液解凍后進行以下檢測。

1） 精子活力檢測

活力通過計算機輔助精子分析系統（CASA）檢測。

2）精子質膜完整性檢測

使用精子低滲透膨脹試驗（HOST）來檢驗精子的質膜完整性。果糖-檸檬酸鈉低滲溶液提前37 ℃預熱，精液解凍，然后與果糖-檸檬酸鈉低滲溶液混合，溶液的添加量使精液終濃度為5×106個/mL，放在37 ℃水浴鍋中15 min，涂片鏡檢，尾部卷曲的是質膜完整的精子，尾部不卷曲的精子是質膜受損的精子，本試驗每次至少計數200個精子，重復5次以上。

3）精子頂體完整性檢測

使用異硫氰熒光素標記的花生凝集素（fl uorescein isothiocyanate peanut agglutinin，FITC-PNA）熒光染色法檢測。解凍后的精液中加入1 mL于37 ℃預熱好的PBS，使用控溫離心機2 400 r/min離心5 min，留下沉淀，在其中加入PBS重懸，反復3次。最后1次用PBS調整精液濃度，使精子密度保持在5×106個/mL左右，混勻，取30 μL均勻涂在載玻片上，自然晾干后用甲醇均勻涂片，室溫下固定10 min，然后在黑暗環境下取30 μL FITC-PNA染液均勻涂在載玻片上，把載玻片放到濕暗盒中，濕暗盒放到37 ℃恒溫箱中，30 min以后取出，PBS緩慢沖洗，黑暗環境下自然晾干。200×熒光顯微鏡下每次計數精子不少于200個，每組試驗重復5次以上，注意激發光波長在480 nm，發射光波長在530 nm。

4）精子DNA完整性檢測

使用AO熒光染色法檢測精子的DNA完整性。精子的前期處理同上，精液解凍，然后用PBS洗3遍，使精子濃度保持在5×106個/mL左右，取30 μL均勻涂在載玻片上，自然晾干后用無水乙醇-冰醋酸（3∶1）固定3 h，放入黑暗環境下新配的AO染液中10 min，PBS緩慢沖洗，黑暗中自然晾干后加石蠟油封片。200×熒光顯微鏡下每次計數精子不少于200個，每組試驗重復5次以上，激發光波長在480 nm，發射光波長在530 nm。

5）線粒體活性檢測

使用碘化丙啶（PI）和羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）共同染色判定。精子前處理同頂體完整性檢測。準備100 μL PBS提前于37 ℃預熱，后續操作均在黑暗環境下進行，在 PBS 中添加 1 μL PI和 1 μL Rh123，溫育10 min，隨后加入50 μL提前處理好的精液樣品，37 ℃水浴鍋中溫育30 min。取溫育好的樣品滴在載玻片上，蓋好蓋玻片，鏡檢，200×熒光顯微鏡下每次計數精子不少于200個，每組試驗重復5次以上，激發光波長在488 nm，發射光波長在513 nm。

6） ROS水平檢測

使用DCFH-DA熒光染色法判定。精子前處理同頂體完整性檢測，離心去上清后使用DCFH-DA染液（10 μM，DMSO溶解）重懸，使精子濃度保持在5×106個/mL左右。精液樣品放入37 ℃水浴鍋中避光溫育30 min，用預熱后的PBS緩沖液洗3次，200×熒光顯微鏡下每次計數精子不少于200個，每組試驗重復3次以上，激發光波長在504 nm，發射光波長在529 nm。

7）抗氧化酶活性、MDA水平檢測

CAT、SOD、GSH-Px的 檢 測和MDA水平的檢測使用試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，進行試驗時嚴格按照試劑盒說明操作，每項檢測重復3遍以上。

1.3 數據分析

本試驗所有數據用SPSS 21.0統計軟件ANOVA分析。本試驗所有數據采用平均值±標準差表示，P＜0.05為差異顯著。采用軟件Image J分析ROS水平。

2 結果

2.1 添加Res對解凍后精子質量的影響

與對照組相比，在冷凍基礎液中添加 25 μM、50 μM Res均可顯著提高解凍后豬精子活力（P＜0.05）。當添加100 μM Res時，與50μM組相比顯著下降（P＜0.05）。當200 μM的Res添加濃度與各添加組相比，精子活力顯著下降，且顯著低于對照組（P＜0.05）。其中添加50 μM 組活力最高（圖1）。

與對照組相比，50 μM Res添加到冷凍基礎液中可以顯著提高解凍后豬精子質膜完整率（P＜0.05），添加200 μM Res可以顯著降低解凍后豬精子質膜完整 率（P＜ 0.05）， 添 加 25 μM、100 μM Res均可提高解凍后豬精子質膜完整率，但差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。

與對照組相比，在冷凍基礎液中添加50 μM Res可以顯著提高解凍后豬精子頂體完整率（P＜0.05），添加25 μM、100 μM Res均可提高解凍后豬精子頂體完整率但差異不顯著（P＞0.05），添加200 μM Res可以降低解凍后豬精子頂體完整率但差異不顯著（P＞0.05（）圖3）。

與對照組相比，在冷凍基礎液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可提高解凍后豬精子DNA完整率，但差異不顯著（P＞0.05）。當Res添加濃度為100 μM時，DNA完整率最高。當Res添加濃度為200 μM時，DNA完整率降低，但差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。

與對照組相比，在冷凍基礎液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著提高解凍后豬精子線粒體活率（P＜0.05），其中50 μM添加組線粒體活率最高，添加200 μM Res可以降低解凍后豬精子線粒體活率，但差異不顯著（P＞0.05）（圖5）。

2.2 添加Res對解凍后精子抗氧化酶、ROS水平、MDA水平的影響

與對照組相比，在冷凍基礎液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著降低解凍后豬精子ROS水平（P＜0.05），當濃度為50 μM時，ROS水平最低（圖6）。

與對照組相比，在冷凍基礎液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著提高解凍后豬精子CAT活性（P＜0.05），其中Res添加濃度為50 μM時，CAT活性最高（圖7）。

與對照組相比，在冷凍基礎液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著提高解凍后豬精子SOD活性（P＜0.05），其中Res添加濃度為50 μM時，SOD活性最高（圖8）。

與對照組相比，在冷凍基礎液 中 添 加 25 μM、50 μM、100 μM Res可以顯著提高解凍后豬精子GSH-Px活性（P＜0.05），其中Res添加濃度為50 μM時，GSHPx活性最高。當Res添加濃度為200 μM時，GSH-Px活性下降，但差異不顯著（P＞0.05）（圖9）。

與對照組相比，在冷凍基礎液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著降低解凍后豬精子MDA水平（P＜0.05），其中Res添加濃度為50 μM時，MDA水平最低。當Res添加濃度在200 μM時，MDA水平升高，但差異不顯著（P＞0.05）（圖10）。

3 討論

Res是可以從虎杖、葡萄等植物中得到的天然非黃酮類多酚抗氧化物質。Res分子中含有酚羥基，可以電離出H+，具有較強的還原性，可以還原氧自由基，減少氧自由基的積累[12]。劉程[13]在研究中發現添加Res可以改善解凍后牛精液的質量參數，包括活率、頂體完整率、質膜完整率、總抗氧化能力、丙二醛水平、GSH-Px活性。Z. D. Zhu等[14]研究發現添加 50 μM Res，能顯著提高解凍后豬精子的運動能力、膜完整率、頂體完整率、線粒體活率、GSH-Px活性、SOD活性、CAT活性等，可以降低解凍后精子的脂質過氧化、ROS水平和凋亡率。證明Res可通過促進5’-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶磷酸化，會導致精子ROS產生水平的降低，抗氧化防御系統在精子中被改善，精子受ROS的影響降低，損傷減小。該研究中發現添加50 μM Res可以顯著改善精液品質，與Z. D. Zhu等人的研究結果一致。說明Res可以有效的應用于豬精液冷凍保存。

精子在冷凍過程中會產生大量的ROS，這些氧自由基會攻擊精子膜、線粒體膜，DNA等，膜損傷導致信號傳遞、物質交流等功能受損，DNA片段化導致遺傳信息傳遞障礙，最終導致凋亡。這些因素使得解凍后的精子品質大大降低[15]。Res作為天然抗氧化劑可以減少ROS的積累，通過清除體內氧自由基，脂質過氧化反應會由此減弱，精子在冷凍過程中因氧化應激而受到的損傷也會由此降低，最終精子品質得到提升。

該研究將天然抗氧化劑Res應用于豬的冷凍精液中，取得較好的效果，說明其可以在凍精實際生產中加以考慮，但是它們對精子保護的多效性機制有待于進一步的研究。

4 結論

豬精液冷凍前添加Res可改良凍融后精子質量，綜合各項試驗結果，添加50μM Res效果最佳，在豬精液生產中具有重要意義。