非洲豬瘟病毒核酸檢測技術與應用進展

莊金山 ，鄧均華 ，田克恭

（1.洛陽普泰生物技術有限公司，河南 洛陽 471000；2.國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471000）

近年來，我國養豬業處于高速發展時期，年出欄肉豬7億頭左右，占世界生豬產量的一半以上，養豬業的穩定發展對我國農業乃至整個國計民生的穩定至關重要。非洲豬瘟（African swine fever，ASF）在我國暴發以來，疫情迅速傳遍全國，給我國養豬業生物安全防控體系提出了嚴峻挑戰，該病也是世界動物衛生組織（OIE）確定必須通報的六種重要豬病之一，我國將此病列為一類動物疫病[1]。

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是有囊膜的雙鏈DNA病毒，根據p72基因的差異，可將ASFV分為至少22個基因型[2]，我國流行的毒株為基因Ⅱ型[3]，目前，ASF尚無疫苗上市。OIE推薦的ASF的實驗室診斷方法有兩類：一類是病原鑒定，包括血細胞吸附試驗（haemadsorption，HAD）、熒光抗體試驗（fluorescent antibody test，FAT）和聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）；另一類是血清學試驗，包括酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、間接熒光抗體試驗（indirect immunoinfluscent assay，IFA）、免疫印跡試驗（immunoblotting test, IBT）。其中，以PCR原理為基礎的核酸檢測方法因其快速、高靈敏度、高特異性等特點，被快速廣泛地推廣應用，在ASF的診斷、感染監測、養殖復產過程中的生物安全評價等方面具有重要意義。

文章從核酸檢測技術的原理與特點、ASFV核酸檢測技術的應用及核酸檢測新技術的應用展望等3個方面進行總結和分析，以期為養豬企業在ASF防控和核酸檢測技術平臺建立方面提供參考借鑒。

1 常用的核酸檢測技術與特點

核酸是生物遺傳物質的載體，由核苷酸聚合而成，包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）；核酸是重要的生物標志物，與生物的遺傳進化密切相關，也是當前疫病病原微生物檢測的目標之一。自1953年DNA雙螺旋結構的發現、中心法則的提出和不斷完善為現代核酸檢測技術的建立與發展奠定了基礎；早在1961年，Hall等建立了利用探針和靶序列在溶液中進行分子雜交的方法，隨后建立的Southern blot和Northern blot方法是對DNA和RNA檢測的經典方法；1977年，Frederick Sanger發明了“雙脫氧終止法”完成了經典的基因測序方法（一代核酸測序）的建立，開啟了核酸測序時代的序幕；1983年，Mullis發明的核酸體外擴增的PCR技術極大提升了核酸檢測技術的敏感性和特異性。分子雜交、基因測序和PCR等三種技術是當代核酸檢測技術基礎，其中PCR技術及其衍生的核酸檢測技術在臨床診斷中應用最為廣泛。

PCR技術發展歷程可分為三個時代。第一代PCR技術是由Cetus公司和加利福尼亞大學1985年聯合創建，通過PCR擴增儀進行擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，操作繁瑣、容易交叉污染，且靈敏度和特異性較低，只能用于定性或半定量檢測。第二代PCR技術是最早由美國ABI公司推廣的實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR），該方法通過增加熒光標記的特異性核酸序列作為探針，極大地提高了檢測的特異性和敏感性，不僅能進行定性分析，也可進行定量分析；然而，qPCR在定量檢測方面仍然存在低拷貝核酸量檢測的穩定性和絕對定量的準確度問題。數字PCR（digital PCR，dPCR）是近年來迅速發展的一種定量分析技術，被認為是第三代PCR技術，該技術可實現不依賴擴增曲線的循環閾值（Ct）判定結果，具有較好的準確度和重復性，且可實現絕對定量分析；2006年，Fluidigm公司率先推出基于芯片的dPCR儀，隨后，Life Technologies公司和Bio-Rad公司也推出了各自的商業化的dPCR儀。

主流的PCR技術所匹配的設備、試劑和耗材價格較昂貴，操作過程繁瑣，更適用于科研和大型醫學檢測實驗室，對于臨床即時檢測（point-of-care testing，POCT）需要更為便捷、性價比更高的產品和技術。對流PCR（convective PCR，cPCR）是近年來發展起來的一種核酸快速檢測技術，最早由Benett等于2001年提出，其原理是通過在毛細管的上下兩端進行加溫，通過溫度差異形成毛細管中液體密度的差異，無需外部的循環泵即可形成循環流動，通過樣品自身的流動完成PCR的過程[4]。2017年，第一臺用于商業化的8孔cPCR擴增儀問世[5]。這種原理使PCR反應的變性、退火、延伸能夠在同一時間內進行，省去了PCR擴增時各個階段的升降溫時間（圖1 B），也降低了儀器的能耗，與傳統的實時熒光PCR儀相比，cPCR擴增儀體積大幅縮小，重量僅有4.5 kg左右（圖1 A），操作界面便于理解，單孔可獨立控制，便于現場樣品的隨時檢測（圖1 C），反應倉操作便捷，雙層反應倉蓋，可減少熒光信號的損失（圖1 D）。洛陽普泰生物技術有限公司已在獸醫領域首次推出基于cPCR技術檢測ASFV的便攜式POCT設備和快速檢測試劑盒[6]。

等溫擴增技術也是近年來發展起來的一類核酸快速檢測技術，包括多種等溫擴增技術，如環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）、依賴核酸序列擴增(nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)、依賴解旋酶擴增(helicase-dependent amplification，HDA)、滾環核酸擴增(rolling circle amplifi cation, RCA)、鏈替代擴增(strand displacement amplification, SDA)等[7]，在臨床診斷領域以LAMP和RPA應用最為廣泛。這些方法的共同特點是可在恒溫條件下通過利用不同功能的DNA聚合酶實現目的核酸模板的快速擴增，降低了反應體系的溫度要求[8]，同時結合熒光探針技術，保證了檢測的靈敏性和特異性，反應體系溫度的降低，也簡化了傳統的熒光定量PCR對儀器工作環境的苛刻要求，更有利于現場檢測的應用。

2 ASFV核酸檢測方法的應用

國內外研究人員很早就建立了針對ASFV核酸的檢測方法。早在1992年[9]，瑞士研究人員就建立了針對ASFV基因組核酸的套式PCR方法，對豬的脾臟和血清進行了檢測，并使用人工合成的質粒DNA作為對照品；2003年，西班牙研究人員[10]建立了基于凝膠電泳的熱啟動PCR方法，該方法明顯提升了對ASFV核酸的檢測靈敏度，擴大了臨床樣品的檢測范圍，可檢測組織、血清及經過EDTA處理過的血液樣品、甚至變質或腐敗的組織，靈敏度優于當時OIE推薦方法；該研究也結合了限制性內切酶酶切的方法對擴增產物酶切分析，省去了測序鑒定的步驟。同年，英國研究人員King[11]等也建立了針對ASFV VP72 基因序列的TaqMan熒光探針法，大幅提升了檢測靈敏度，縮短了檢測時間，可在封閉的反應管內進行結果的判定，省去了可能存在污染的瓊脂糖凝膠電泳的步驟，上述兩種方法也是當前OIE推薦的方法。

熒光定量PCR方法與基于凝膠電泳的傳統PCR方法相比具有的明顯優勢而被很多科研機構所認可。2007年，國內學者李維彬等[12]建立了針對ASFV VP72基因序列的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，使用質粒作為參比模板，檢測靈敏度可達到100個拷貝。2010年，郭少平等[13]針對ASFV K205R基因設計了引物和探針，建立了實時熒光定量PCR方法，對質粒模板的檢測靈敏度可達10個拷貝。2009年，江彥增等[14]針對ASFV P72基因建立了LAMP的檢測方法，可在30 min內完成擴增反應，對質粒模板的檢測靈敏度可達到5個拷貝。2016年，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所的研究人員與瑞典、烏干達等國的研究人員聯合建立了一種新的熒光定量PCR方法，用于檢測ASFV VP72基因序列，檢測靈敏度可達到60個拷貝[15]。除了熒光定量PCR方法外，環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組聚合酶等溫擴增（RPA）等技術也有被應用于ASFV核酸檢測的報道。2017年，哈登楚日亞等針對ASFV P72基因建立了RPA的檢測方法，在39 ℃、20 min內即可檢測到10個拷貝的質粒DNA模板[16]。

正是基于ASFV核酸檢測的儲備性研究，自2018年8月ASF傳入我國之后，國內企業和相關研究機構快速啟動了ASFV核酸檢測產品研發，并快速推出了一系列的產品。2019年1月和6月，中國動物疫病預防控制中心先后兩次公布了非洲豬瘟現場快速檢測試劑的評價結果，最終34個核酸檢測產品通過了評價，包括28個熒光PCR類和6個等溫擴增類產品。其中，除了熒光PCR技術外，基于熒光探針法和PCR技術原理一些新的技術和工藝在這些產品中得到應用，如免提取核酸技術、cPCR、微流控技術、LAMP、RPA、產物降解技術、凍干工藝等[6]。隨著國家推動第三方檢測機構參與ASF的檢測并推動屠宰和養殖企業建立檢測實驗室進行自檢，核酸檢測技術已被廣泛地應用于ASF生物安全防控的各個環節。

當前，ASFV核酸檢測試劑盒的廣泛應用，一方面得益于核酸檢測試劑和工藝的研究成果，另一方面也得益于擴增儀器的小型化和成本的降低；ASF疫情的暴發，使養殖企業和相關機構對核酸檢測平臺的建設高度重視，核酸檢測儀器、試劑盒的應用空前普及，在ASF的診斷、監控和復產過程中發揮了重要的作用，但檢測質量還有很大的提升空間，樣品采集、樣品處理、核酸提取與純化、人員技術水平、操作環境的交叉污染等多種因素影響著核酸檢測技術的穩定應用。未來，在提升檢測的靈敏性和特異性的基礎上，提升產品操作的便捷性、可靠性將是ASFV核酸檢測產品研發的趨勢之一。

3 新技術在ASFV核酸檢測領域的應用展望

當前，qPCR技術是ASFV核酸檢測主流技術，但cPCR、LAMP、RPA等技術也顯示了強大的競爭力，隨著生物技術和機電技術的發展，核酸診斷試劑的發展和相配套的儀器的發展相輔相成，眾多新的產品形式不斷涌現，但整體方向是向著更準確和更便捷兩個方向發展。

dPCR是一種新型的核酸分子絕對定量技術，Wu Xulong等建立了ASFV核酸檢測的dPCR方法，檢測限可達10個拷貝/反應，比實時熒光定量PCR檢測靈敏度高10倍左右[17]，在ASFV傳播途徑分析和環境樣品的監測均有重要的作用；雖然當前dPCR技術所需的設備還比較昂貴，但隨著技術的發展，dPCR設備已經實現了國產化，未來的應用成本將會進一步降低。牛津納米孔測序技術也顯示出其在ASFV 核酸檢測方面的應用潛力，O`Donnell等利用便攜式牛津納米孔測序儀結合ASF快速分析測序軟件（ASF-FAST），可在10 min內快速從臨床樣本中進行ASFV基因組測序分析，從而達到快速準確診斷的目的[18]。

核酸提取和擴增一體化技術是核酸檢測技術發展的另一個方向，已經廣泛應用于人醫檢測領域，如Cepheid公司的GeneXpert system、Atlas Genetics公司的io檢測平臺、BioFire公司的FilmArray、GenePOC公司的revogenne、北京博暉創新公司的GenPlex?等均可實現“樣品進，結果出”。這些產品和技術平臺融合了微流控、凍干、恒溫擴增、電化學等在內的多種技術和工藝，很好地解決了傳統核酸檢測方法試劑保存難和操作流程繁瑣的問題。

在獸醫領域，試劑和設備的成本是限制新技術推廣應用的重要原因之一，如何降低試劑和設備的成本應該是未來需要解決的問題。因獸醫診斷試劑市場容量較小，獸醫領域的核酸診斷試劑公司在新技術方面的投入較少，而擁有更多技術儲備的公司多集中在人醫領域。未來，二者的技術資源和市場資源整合或許能為獸醫領域核酸診斷試劑的發展提供機遇。此外，試劑工藝研發和POCT設備研發可加快核酸檢測產品在獸醫檢測領域的應用，如核酸檢測試劑全預混凍干工藝[19]、便攜式核酸提取+擴增一體機設備、生物傳感器技術[20]等可以大大降低基層獸醫人員進行檢測操作的技術難度。

4 小結

ASF的暴發推動了核酸檢測技術在畜牧業生物安全防控體系中的應用。未來，提升行業技術人員操作水平的同時，構建POCT化的核酸檢測平臺將是未來核酸檢測技術在畜牧業生產中發揮作用的主要方向。