微小RNA- 139- 5p對AS患者血管平滑肌細胞增殖和遷移作用的研究

白蓓蓓，劉偉，王海萍

(1.青島大學附屬醫院 神經內科，山東 青島 266000；2.諸城市人民醫院 神經內科，山東 濰坊 262200)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種由細胞、膽固醇和細胞外基質聚集而導致動脈壁增厚和硬化引起的疾病[1- 2]，血源性炎癥因子、免疫細胞、血管內皮細胞和血管平滑肌細胞(VSMCs)是AS病變的主要組成部分[3]。AS在發達國家與發展中國家發病率和死亡率呈不斷上升的趨勢，可以導致心肌梗死、缺血性中風和外周動脈疾病[4]。VSMCs的異常增殖和遷移參與了AS的發生發展[5]，有必要針對VSMCs的異常行為發展治療AS的有效方法，研發新的有效的AS標志物對疾病的早期診斷和治療具有重要意義[6]。

微小RNA(miRNAs)是長度為18～24個核苷酸的單鏈非編碼RNA分子，通過與靶基因的3′非翻譯區(UTRs)相結合發揮作用。miRNA在血管壁表達豐富，可作為多種血管疾病過程中的重要調控因子[7]。多個miRNAs被報道通過調控VSMCs的增殖、遷移和侵襲參與AS的進程， 如miR-21[8]、 miR-133a[9]、miR-665 等。miR-139-5p位于人類染色體11q13.4區，是一種常見的腫瘤相關的miRNA。最近的報道指出miR-139-5p是一種新型的心肌細胞抗增生性的miRNA，可以通過下調體外C-Jun的表達來減輕心肌肥厚[10]。miR-139的過表達可以調控多種與心臟缺血再灌注相關的細胞應激、代謝、細胞存活和凋亡等功能[11]。此外，熒光標記探針(TaqMan)miR陣列顯示，與急性冠狀動脈疾病患者相比，miR-139-5p在穩定的冠狀動脈疾病患者中異常表達，參與了血管性能的調節作用[12]。雖然miR-139-5p能影響AS的多種常見并發癥，然而miR-139-5p在AS發展中的準確作用和詳細機制尚未見報道。本研究通過對比miR-139-5p在健康人群和AS患者中的表達水平，評估miR-139-5p對AS的診斷價值，探討miR-139-5p對AS中VSMCs生物學行為的調控作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經過青島大學附屬醫院倫理委員會批準，所有參與研究人員均簽署知情同意書。實驗共招募了190名受試者，包括112例AS患者(AS組)和78名健康志愿者(對照組)。本研究使用頸總動脈內膜-中膜厚度(CIMT)作為AS的診斷標準， CIMT<0.8 mm為非AS狀況，CIMT≥0.8 mm為AS[13]。CIMT值使用ATL HDI 3000超聲系統(Advanced Technology Laboratories, Bothell, WA) 檢測，配備5 MHz線性陣列換能器。記錄所有受試者的人口學特征和臨床資料，排除有臨床大血管疾病、嚴重心腦血管疾病(急性心肌梗死、心力衰竭、中風等)、糖尿病、癌癥、吸煙、頸部手術、風濕性免疫疾病或有相關治療史的受試者。每名受試者禁食1晚后采集外周血漿，分離血清，-80 ℃保存備用。

1.2 細胞培養及轉染

人的血管平滑肌細胞(HVSMCs)(ATCC, USA)用含有10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養基于37 ℃ 5%CO2的培養箱中培養。待細胞長至對數生長期時進行轉染，轉染試劑為脂質體(Lipofectamine) 2000(Invitrogen，USA)，轉染載體分別為miR-139-5p 模擬物、miR-139-5p 抑制物及模擬物對照、抑制劑對照。轉染6 h后換液繼續培養。

1.3 RNA提取及實時熒光定量PCR

用TRIzol(Invitrogen, USA)試劑提取轉染后細胞總RNA和血清RNA，并將RNA逆轉錄成cDNA。采用SYBR green I Master Mix試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)在ABI 7300實時PCR系統(Applied Biosystems, Waltham, USA)進行qRT-PCR反應。以U6作為內參，miR-139-5p的相對表達量用2-ΔΔCt的方法計算。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力

將轉染后處于對數生長期的HVSMCs細胞以每孔5×103的數量接種于96孔板中繼續培養3 d，每隔24 h進行檢測，檢測前向每孔中添加10 μl CCK-8試劑，放培養箱中繼續培養1 h，然后放置酶標儀上震蕩1 min，檢測490 nm處吸光值的變化。連續檢測3 d后評估miR-139-5p對HVSMCs細胞增殖能力的影響。

1.5 Transwell法檢測細胞遷移能力

將轉染后的細胞進行消化，用無血清培養基制備成細胞懸液，并計數。取200 μl含3×104個細胞的懸液添加至Transwell小室的上室，下室添加500 μl含10%FBS的培養基。在培養箱中培養24 h，將小室取出，用棉簽將上室中未遷移的細胞擦拭掉，用4%多聚甲醛固定10 min后，0.1%的結晶紫染色20 min，清洗晾干后在顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照并計數，檢測miR-139-5p對HVSMCs遷移能力的影響。

1.6 統計學處理

使用SPSS 21.0軟件以及GraphPad Prism 7.0軟件進行數據分析和處理，采用Student’st檢驗和單因素方差分析比較各組間的差異。使用斯皮爾曼相關系數評估連續變量之間的相關性。采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評估miR-139-5p在AS中的診斷價值，并計算曲線下面積(AUC)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料的比較

與對照組相比，AS組患者的年齡、性別、體重指數以及總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯水平差異無統計學意義(P>0.05)，AS組的C反應蛋白(CRP)水平顯著高于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組一般資料的比較

2.2 miR-139-5p在兩組血清中表達水平的比較

與對照組相比，AS組血清miR-139-5p的表達水平明顯下調(P<0.001，圖1)。

a 與對照組比較，P<0.001

2.3 AS患者miR-139-5p的表達量與CIMT的關系

AS患者血清miR-139-5p表達水平與CIMT呈負相關(r=-0.757 9,P<0.001, 圖2)。

圖2 AS患者miR- 139- 5p與CIMT的關系

2.4 miR-139-5p對AS患者的診斷價值

ROC曲線分析顯示，AUC為0.888，靈敏度為86.60%，特異性為84.60%，截斷值為1.737 5(圖3)，miR-139-5p對AS診斷的準確性較高。

2.5 miR-139-5p對HVSMCs增殖和遷移的調控作用

采用qRT-PCR實驗對轉染效率進行驗證，結果顯示，miR-139-5p模擬物組中miRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.001)，而miR-139-5p抑制組的表達量顯著低于對照組(P<0.01)，見圖4A。

采用CCK-8實驗驗證miR-139-5p對HVSMCs增殖能力的影響， 結果顯示，miR-139-5p模擬物組的增殖能力顯著低于對照組(P<0.01)，而miR-139-5p 抑制劑組的增殖能力顯著高于對照組(P<0.01)，miR-139-5p低表達能顯著促進HVSMCs的增殖能力，見圖4B。采用Transwell實驗驗證miR-139-5p對HVSMCs遷移能力的影響，結果顯示，miR-139-5p模擬物組的遷移能力顯著低于對照組(P<0.001)，而miR-139-5p抑制劑組的遷移能力顯著高于對照組(P<0.001)，見圖4C。

3 討 論

本研究結果表明，與對照組相比，miR-139-5p在AS患者血清中的表達水平顯著下降，與已有研究[10- 11]的結果一致。實驗結果表明miR-139-5在AS進展中可能發揮著重要作用。此外，本研究還對受試者血清CRP的濃度進行了檢測，結果表明在AS患者中CRP濃度顯著增加。多項研究[14- 17]報道慢性炎癥參與AS形成的所有階段，包括早期粥樣硬化形成、斑塊的不穩定、血栓形成和心血管事件的發生等。CRP作為炎癥的非特異性標志物，是心血管疾病有效的預示因子和危險因子。我們的研究結果證實AS患者中CRP的濃度與對照組相比顯著升高，與已有的研究結果一致。

本研究還發現AS患者血清中miR-139-5p的表達水平與CIMT值呈負相關。CIMT是美國心臟協會和美國心臟病學會推薦的一種超聲檢測結果，因實時、安全、快速、無創等特點，在臨床上被認為是亞臨床動脈粥樣硬化的重要指標，且CIMT的增加與多種心血管危險因素有關。在我們的研究中CIMT值較高的患者血清miR-139-5p的表達水平降低，兩者呈負相關。同時本研究還通過ROC曲線評估miR-139-5p在AS中的診斷價值，結果表明miR-139-5p是一種具有高敏感性和特異性的潛在診斷生物標志物。miRNA在AS中的診斷價值已經被廣泛研究。在本研究中，miR-139-5p的低表達被認為是AS中的一個新的潛在生物標志物。

我們對miR-139-5p調控HVSMCs的體外功能進行了檢測，結果表明miR-139-5p的過表達會顯著抑制HVSMCs的增殖和遷移能力，而降低miR-139-5p的表達會顯著的促進細胞的增殖和遷移能力。AS發生的過程與VSMCs異常的增殖和遷移相關，且多種miRNAs已經被報道參與并調控AS中VSMCs的功能變化[18]。此結果與miRNAs可以調控AS中VSMCs增殖和遷移能力的結果是一致的，表明miR-139-5p對HVSMCs的生物學行為具有抑制作用，這可能是miR-139-5p在AS中作用的潛在機制。此外，已有報道[10]證實miR-139-5p通過靶向調控C-Jun蛋白進一步調控AS的并發癥心肌肥厚，因此我們猜測miR-139-5p對AS的影響通過調控C-Jun進行，但此猜測仍然需進一步驗證。

本研究結果證實了miR-139-5p在AS患者血清中表達下調，且miR-139-5p表達下調是AS潛在的診斷標志物。體外研究結果表明，過表達miR-139-5p可顯著抑制HVSMCs的增殖和遷移能力。綜上所述，miR-139-5p可能是AS臨床診斷的潛在生物標志物，調控HVSMCs的生物學功能有望成為AS治療的潛在靶點。