酶在液體洗滌劑中的穩定性研究進展

靳計燦，劉海峰，黎根盛，李瑞，林銳，曾暉，張少雄

(1.中山大學 化學工程與技術學院，廣東 珠海 519082；2.中山大學 廣東新材料產業基地聯合研究中心，廣東 佛山 528244；3.華南農業大學 材料與能源學院，廣東 廣州 510640；4.廣東優凱科技有限公司，廣東 佛山 528244)

由于人們對綠色洗滌劑產品需求的提高，而酶制劑正是綠色化學工藝中的理想催化劑[1]，這就為含酶洗滌劑的發展提供了契機。對于洗滌劑用酶，可以追溯到20世紀60年代，丹麥諾沃公司推出了一種來自地衣芽孢桿菌的細菌內蛋白酶，作為洗滌配方的成分[2]，使洗滌用品的去污效果得到大大提高。初期的洗滌產品大部分都是粉末，隨著包裹造粒等技術的發展，使酶與洗滌配方體系中的組分相隔絕開，減少了酶與其它組分的接觸，從而使粉狀的洗滌產品的酶穩定性問題得到了解決。但是隨著粉狀洗滌劑向液體洗滌劑的轉變，酶的穩定性問題再一次成為了人們關注的焦點，成功地使用酶助劑已經成為生產具有成本效益、對環境無害的驅動力，酶制劑的加入對于各類型洗滌產品的創新發展均具有很大的助推力[3]。但是酶制劑因為其生物屬性使其在洗滌劑工業應用中特別容易受到外界影響而失去活性。所以，研究酶在洗滌劑溶液中(主要是表面活性劑溶液)的穩定性，探討洗滌劑配方組分的表面活性劑等組分對酶的活性的影響，是一個非常重要的課題。

本文主要介紹了近年來酶在表面活性劑溶液中的穩定性研究進展，并進一步探討了復合酶在液體洗滌劑中的穩定性問題，對酶在洗滌領域的相關應用進行了展望。

1 單一酶在表面活性劑溶液中的穩定性

為了使酶制劑在洗滌或清潔劑中使用，其存儲期間的穩定性和清潔性能在很大程度上取決于各個組分的混合物[4]，其中表面活性劑是洗滌劑中最關鍵的組分，是洗滌劑中的重要去污組分，但是表面活性劑與酶之間的相互作用，能夠使酶結構發生變化使其失活[5]，所以探討不同洗滌劑用酶在表面活性劑溶液中的穩定性是一個非常重要的研究課題。

1.1 蛋白酶

蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶[6]。在洗滌劑種類中，蛋白酶可以說是最重要、應用最廣泛的酶，這是因為像奶、血、汗漬等蛋白質占據了織物污垢的大多數，而且表面活性劑和其他助洗劑很難將其去除。在很多文獻的研究中，對于含酶洗滌劑配方體系，蛋白酶對于陰離子型表面活性劑的敏感性特別大，相對于陰離子表面活性劑，非離子表面活性劑引起的問題要少得多[7]。

楊慶利等[8]研究了常用的陰離子表面活性劑對液體蛋白酶的影響，發現了在液相混合組分中，由陰離子表面活性劑所電離的離子所帶的電荷會導致蛋白質空間結構發生變化，并且其疏水基團和親水基團可能會分別與酶分子相互作用，從而影響酶活性。實驗結果顯示，各表面活性劑影響程度如下：LAS>AOS>AES>AEC，可以看出AEC的離子強度以及表面活性劑分子與酶的作用力相比其他表面活性劑來說是最弱的。

吳美娜等[9]基于洗衣液的主要成分考察了表面活性劑AES、AEO、APG等對蛋白酶活性的影響，結果分析可知，添加非離子表面活性劑吐溫系列和APG系列的酶活性低于添加硼砂穩定劑的酶活，但是優于空白試驗的酶活，可見系列非離子表面活性劑對酶活的穩定性保持起到了一定的作用；非離子表面活性劑AEO7和AEO9對于酶的活性基本沒有影響，但是酶分子與陰離子表面活性劑AES之間的相互作用會顯著降低酶的活性，而且對于混合表面活性劑體系，在未來可以增加 AEO與APG的混合使用，因為AEO與AES的混合使用并不會有效地提高液體酶的活性。

目前，很少有人對酶與表面活性劑之間的相互作用進行系統的研究，所以表面活性劑是怎么與酶相互作用使其失活的，這仍然是該領域面臨的一個重要挑戰。Zhang等[10]研究了AES、AEO、APG表面活性劑的結構對蛋白酶活性的影響，結果表明，陰離子表面活性劑LAS對酶活的影響最大，這主要是因為其結構中存在苯環；非離子表面活性劑AEO系列對酶有較小的影響，且其結構中環氧乙烷的個數越多，對酶的影響就越大；APG非離子表面活性劑比AEO對酶的影響還小，原因是除了其無法在水溶液中進行電離之外，還有就是在相同的疏水基團下，葡萄糖親水基團比環氧乙烷基團對蛋白酶的影響更小。

關于含酶洗滌劑的開發，探索更適合洗滌環境的酶也十分重要。Haddar等[11]選用來自于莫來芽孢桿菌A21的兩種絲氨酸堿性蛋白酶(BM1和BM2)，發現兩者在洗滌劑濃度下對于吐溫80和Triton X-100此類的非離子表面活性劑均顯示出高穩定性，其中BM1和BM2兩種蛋白酶的最適宜的pH值分別是8～10和10，在高堿性條件下能保持高活性的特性使其成為理想的酶制劑。

1.2 脂肪酶

脂肪酶能夠將天然底物油脂催化降解成脂肪酸等物質，譬如油漬類的污垢就能夠被有效的去除[12]，由于脂肪酶的這種特性，越來越多的研究開始將脂肪酶應用到其高端洗滌產品中。關于表面活性劑對脂肪酶活性的影響，人們探討最多的還屬陰離子表面活性劑，該類表面活性劑由于具有優異的清潔性能和相關的低生產成本，被用于大多數洗滌劑配方中，特別是那些具有脂肪族十二烷基的表面活性劑，由于在乳化效率和水溶性之間的折衷性，這些表面活性劑是首選的。在眾多表面活性劑中，十二烷基硫酸鈉(SDS)和具有兩個EO單元的十二烷基醚硫酸鈉(SLE2S)，是工業應用中常見的表面活性劑，由于其結構相似(見圖1)，所以Magalhaes等[13]從表面活性劑的結構對酶的活性的影響進行研究，評估了陰離子表面活性劑的乙氧基團(EO)對脂肪酶的結構和活性的作用，在上述兩種表面活性劑的存在下，評估蛋白質的構象變化和酶活性。結果表明，表面活性劑中的EO單元的存在決定了酶的穩定性和活性，SDS促使酶的變性和相應的活性損失，而SLE2S保持酶的結構和活性；該項工作的實驗數據也進一步強調了蛋白質基團之間的靜電相互作用，因吸附的陰離子表面活性劑的存在而發生改變，這種吸附主要是由疏水相互作用驅動的。

圖1 十二烷基硫酸鈉(SDS)和十二烷基醚硫酸鈉(SLE2S)的結構圖[13]Fig.1 Structural diagram of sodium dodecyl sulfate(SDS)and sodium dodecyl ether sulfate(SLE2S)

Nerurkar等[14]選擇了一種從海洋細菌提取的脂肪酶作為酶添加劑摻入洗滌劑溶液，考察了在1%(w/v)的酶濃度下與不同的表面活性劑和洗滌劑在40 ℃下孵育1 h的效果，結果表明脂肪酶活性在表面活性劑(山梨醇酐油酸脂Span-80、三聚磷酸鈉)、水柔軟劑(硫酸鈉)、氧化劑(過硼酸鈉四水合物)和AATCC洗滌劑的存在下與空白對照樣品對比是增加的(圖2)，在此基礎上又考察了其去除玉米油的效率，發現在洗滌劑中添加脂肪酶顯著提高了織物上玉米油的去除效率(約20%)；而且該脂肪酶具有堿性最適pH值以及在廣泛的溫度范圍內仍能保持高活性、高穩定性，說明該類脂肪酶適合用作洗滌劑配方中的添加劑。

圖2 不同表面活性劑和洗滌劑對脂肪酶活性的影響[14]Fig.2 Effects of different surfactants anddetergents on lipase activity

1.3 淀粉酶

淀粉酶能夠將大分子的淀粉催化水解成小分子的還原糖等物質，所以將其應用于洗潔精中，可有效去除含有淀粉基的污漬，如盤子上的米糊，糊狀的馬鈴薯等。基于此，葉飛燕[15]研究了洗潔精中常用的表面活性劑對液體淀粉酶的穩定性影響，結果表明幾種表明活性劑對酶的負影響程度為LAS>AOS>AES>AEO9，不過非離子表面活性劑AEO9與LAS復配后會顯著提高酶的穩定性，而且在配方體系中加入穩定劑氯化鈣，能夠顯著提高酶的穩定性，推測可能是由于鈣離子與酶的結合對酶的活性有激活作用[16]。Singh等[17]測定不同濃度的表面活性劑和酶復配后的生物降解性，發現含有1%淀粉酶和0.118 g十二烷基硫酸鈉的樣品以及含有1%淀粉酶和2.7 μL吐溫20的樣品生物降解性最小，因此，該濃度的淀粉酶和表面活性劑復配體系可以用于具有高降解性的洗滌劑配方。

1.4 纖維素酶

纖維素酶可以有效地將纖維素分解成寡糖或單糖，可除去微纖維和附著在微纖維上的顆粒污垢，對織物表面起更新作用。纖維素酶被添加到洗滌劑中，可提高織物的平滑度，而不會對其造成損害，從而保持織物的質量[18]。在表面活性劑溶液條件下，研究其與纖維素酶的作用機理有一些報道，但是很少有報道用相應的表征手段對其作用機理進行合理的解釋，于躍等[19]通過動態光散射(DLS)、熒光光譜及傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(ATR-FTIR)探討了表面活性劑和纖維素酶的相互作用機理，DLS實驗結果表明在陰離子表面活性條件下，陰離子表面活性劑的磺酸基團具有較大的電離度，極大地促進了酶分子表面與表面活性劑之間發生吸附作用，進而改變了纖維素酶的結構，所以研究體系中的Zeta電位分布在較低的負電荷區域；而非離子表面活性劑-纖維素酶與蒸餾水-纖維素酶體系中的Zeta電位的分布沒有明顯的區別，主要是因為非離子表面活性劑與酶分子之間的相互作用依靠于氫鍵，并不會導致纖維素酶結構發生變化，且非離子表面活性劑亦不會電離出帶電荷的離子基團來影響酶分子結構。熒光ATR-FTIR 實驗說明了陰離子表面活性劑對纖維素酶的二級結構和側鏈的微環境都有很大的影響；在很多洗滌劑配方中含有不止一種類型的表面活性劑，而且混合物表面活性劑相比僅含有單一種類的表面活性劑其CMC值會有所降低且性能更好[20]，所以在該項工作中還測試了混合表面活性劑對酶的影響，實驗中采用陰離子表面活性劑AES(2EO)和非離子表面活性劑AEO2復配，結果顯示，加入AEO2能夠顯著地改善AES(2EO)與纖維素酶的兼容性，這主要是因為復配后形成了混合膠束，在以陰離子表面活性劑為主的膠束中插入了非離子表面活性劑，使相鄰分子間的電荷斥力降低，從而形成了更小的膠束，而且膠束的電荷密度降低，對酶活力影響變小[21]。

由于生產成本較高，纖維素酶的利用受到阻礙，未來的趨勢是開發木質纖維素生物質和綠色生物技術[22]，以實現可持續增長。因此，尋找具有更好特性的纖維素酶是一項持續的工作。

2 復合酶在表面活性劑溶液中的穩定性

很多含酶洗滌劑只含有單一種類的酶，但是單一種類的酶無法去除多種污垢，這是因為酶催化反應具有專一性，在工業生產中只添加一種酶制劑是無法生產出高效去污的產品。因此，在洗滌產品中需要加入多種酶，比如纖維素酶與其他酶進行 1∶1 復配時，去污效果得到了顯著的提升，這是因為復配酶中的纖維素酶能夠使織物的纖維結構蓬松起來[23]，使其它酶能夠充分地與嵌入在纖維結構中的污漬相互作用，進而提高了其去污的效果。張紅艷等[24]以堿性蛋白酶的相對活性作為衡量指標，研究了8種常用表面活性劑在不同體系下對去血漬復合酶活性的影響，結果表明，在這些表面活性劑中，有7種表面活性劑可以很好的與酶穩定的共存，可有效地發揮各組分的去污作用，只有LAS不利于酶的穩定性，但是如果LAS與其他組分分別按照同等比例混合的話，可顯著減少LAS對酶活的負面影響，這說明表面活性劑之間適當復配可有效地增強液體酶的穩定性。不過需要注意的是在含有多酶復合的洗滌劑中，其中的酶不僅能夠對污漬進行降解，而且也會對洗滌劑配方體系中其他酶進行降解。所以，既要解決酶與表面活性劑等其它組分的共存問題，也需要解決酶與酶之間的共存問題。Fang等[25]發明了一種穩定液體復合酶洗滌劑中脂肪酶和蛋白酶的方法，通過一定的方法制備囊泡包裹的蛋白酶溶液和囊泡包裹的脂肪酶溶液，使其混合形成囊泡濃縮液，得到的酶泡濃縮液直接用于洗衣液中，其脂肪酶不會被蛋白酶降解，而且囊泡中的酶還能抵抗表面活性劑的抑制。在液體洗滌劑中，為了降低蛋白酶對淀粉酶活性的影響，往組分體系中加入一定比例的4-甲酰苯基硼酸來抑制蛋白酶的活性，而在經水稀釋后的實際洗滌濃度下蛋白酶的活性并不會受到抑制，即不會影響蛋白酶去污功效的發揮，從而提高了兩種酶的協同去污效率[26]。

對于酶制劑的應用，國內市場與國外發達市場最大的差距就在于復合酶的使用，國內目前絕大部分洗滌產品只使用了單一酶[27]，很少使用復合酶，在這方面國內對于復合酶制劑的研究與開發仍需要很多的工作要做。

3 展望

在液體洗滌劑中，保持酶的穩定性重點在于解決表面活性劑與酶的配伍問題。鑒于表面活性劑與酶的使用種類不同，所以需要研究說明哪種表面活性劑最有利于酶的穩定性以此作為指導原則。作為一般性規則，非離子表面活性劑一般情況下比離子型表面活性劑對酶更有利，這種差異主要歸因于表面活性劑與酶的綁定模式的不同，非離子表面活性劑只能通過疏水相互作用與酶結合，而離子型表面活性劑可以通過靜電吸引和疏水相互作用結合。為了能夠更好地提高液體酶穩定性，除了研究表面活性劑與酶的配伍之外，人們往往還會關注穩定劑及其多組分的最優配伍方面，這對于酶制劑的工業應用起到了至關重要的作用。而且，隨著綠色環保的要求逐漸提高，在未來開發與酶更適配的綠色表面活性劑、穩定劑等洗滌劑成分將會成為重要的研究方向；同時，從配方與生產工藝的角度來分析，對含酶洗滌劑進行濃縮化工藝升級來提高酶穩定性會越來越得到重視。