響應曲面法優化提取柴胡總皂苷的工藝

姬海剛，楊秀芳，2，惠昱昱，郭林新

(1.陜西科技大學 化學與化工學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 陜西省輕化工助劑重點實驗室，陜西 西安 710021)

柴胡為傘科植物柴胡(BupleuremChinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleuremscorzonerifoliumWilld)的干燥根，是常用的傳統中藥[1-3]，東北和陜西等地是柴胡的主要產區[4]。柴胡具有疏散退熱和疏肝解郁等功效[5]，臨床上用于感冒發熱癥狀[6]。皂苷是柴胡中的主要生物活性成分之一。但是目前對秦嶺太白山區柴胡皂苷的提取報道很少。本文采用乙醇加熱回流提取法通過Design-Expert軟件設計響應曲面提取柴胡總皂苷[7],為合理開發該地區柴胡的藥用價值提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

柴胡，采自陜西太白山區，經西北農林科技大學林學院康永祥教授鑒定為柴胡 (BupleurumChinenseDC.)；香草醛，高純級；柴胡皂苷a，色譜純；乙醇、甲醇、冰乙酸、高氯酸等均為分析純。

723N可見分光光度計；Cary 5000 紫外-可見-近紅外分光光度計；DFY-200C高速萬能粉碎機；DZKW-D-4 電熱恒溫水浴鍋；RE-52A旋轉蒸發器。

1.2 實驗方法

柴胡粉碎過40目篩。稱取適量的柴胡粉末，置于圓底燒瓶，加入濃度70%的乙醇溶液，料液比 1∶20 g/mL，加熱回流，提取3 h。趁熱過濾，收集濾液，減壓回收乙醇，得浸膏。測定柴胡皂苷含量，計算柴胡總皂苷的得率(%)。

柴胡總皂苷得率=(提取液中柴胡皂苷含量×供試品溶液體積)/柴胡質量×100%

1.3 分析方法

1.3.1 供試品溶液的制備 定量稱取浸膏，用甲醇定容于50 mL的容量瓶，4 ℃保存備用。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a標準品2.4 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中。

1.3.3 檢測波長的確定 精密移取對照品溶液200 μL，以甲醇為空白對照，水浴揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液200 μL，高氯酸800 μL，在60 ℃水浴中放置15 min。取出，用流動水冷卻至室溫，加入冰醋酸5.0 mL，搖勻[8]。在400～800 nm處進行紫外掃描，結果見圖1。

圖1 柴胡總皂苷在不同波長下的掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectra of total saikosaponins of BupleurumChinense DC at different wavelengths

由圖1可知，最大吸收波長在610 nm，與鐘巧妮等[9]報道的結果基本一致。

1.3.4 標準曲線的繪制 分別精密移取柴胡皂苷對照品a溶液0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL，揮干溶劑，按1.2.3節的顯色方法操作，在波長610 nm處用可見分光光度計測定溶液的吸光度，以溶液的濃度(C)作為橫坐標，吸光度(A)作為縱坐標，作圖，得線性回歸方程A=29.667C+0.086 8，R2=0.999 1，線性關系良好。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑對柴胡總皂苷得率的影響

不同的提取溶劑對植物不同成分的提取影響較大，提取溶劑與目標成分極性相似時，則容易提取目標成分[10]。本文從綠色環保的角度考慮，選擇常用的溶劑乙醇與水作為提取溶劑。乙醇濃度40%，料液比1∶20 mg/L，提取時間60 min，提取溫度 60 ℃，結果見圖2。

圖2 提取溶劑對總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the yield of total saponins

由圖2可知，用乙醇提取的得率明顯高于水提得率。所以，選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2 乙醇濃度對柴胡總皂苷得率的影響

料液比1∶20 mg/L，提取時間60 min，提取溫度60 ℃，乙醇濃度的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of total saponins

由圖3可知，當乙醇濃度升高時，柴胡總皂苷的得率增加，但當乙醇濃度超過70%以后，總皂苷得率開始下降。這是因為由于乙醇濃度的增加，醇溶性雜質和色素等成分溶出以及溶液極性的變化導致總皂苷得率下降[11]。因此，選擇70%。

2.3 料液比對柴胡總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%，提取時間60 min，提取溫度 60 ℃，料液比的影響，結果見圖4。

圖4 料液比對柴胡總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on yield of total saponins

由圖4可知，隨著料液比的增加，柴胡總皂苷的得率上升，當料液比<1∶20 g/mL時，上升的趨勢較快，說明在此料液比的范圍內，增大溶劑的量對總皂苷的得率提升較大。但當料液比>1∶20 g/mL時，繼續增加溶劑的量對總皂苷得率的提升較小。因此，選擇料液比1∶20 g/mL。

2.4 提取時間對柴胡總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%，料液比1∶20 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時間的影響見圖5。

由圖5可知，延長提取時間，總皂苷得率先增加后降低。總皂苷得率在150 min達到最大值。原因可能是在提取的初始階段，隨著提取時間的增加，有利于皂苷和其它極性化合物的溶解。然而，隨著時間的延長，由于長期處于溫度較高的環境，柴胡總皂苷部分分解[12]。因此，選擇150 min。

圖5 提取時間對柴胡總皂苷得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on yield of total saponins

2.5 提取溫度對柴胡總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%，料液比1∶20 g/mL，提取時間150 min，考察提取溫度對柴胡總皂苷得率的影響，結果見圖6。

圖6 提取溫度對柴胡總皂苷得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on yield of total saponins

由圖6可知，提取溫度增加，總皂苷得率先增大后減小，提取溫度60 ℃時,總皂苷得率最高。因為隨著溫度的升高，溶劑分子運動加快，促進溶劑分子更快進入柴胡細胞內。所以在60 ℃之前，隨著溫度的升高，溶劑分子運動加快，柴胡總皂苷的得率增加。但當溫度超過60 ℃時，部分柴胡皂苷在較高溫度下分解，總皂苷得率下降[13]。因此，選擇60 ℃。

2.6 響應曲面法優化柴胡總皂苷的提取條件

在單因素實驗的基礎上，通過Box-Behnken進行實驗設計，采用Design-Expert軟件對乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度進行優化，因素與水平見表1，結果見表2。

表1 響應曲面的因素水平表Table 1 Factor level table of design response surface

表2 響應面法實驗結果Table 2 Results of response surface experiment

2.6.1 建立回歸方程 上述實驗結果通過Design-Expert軟件進行分析，得回歸方程Y=3.01-0.11A-0.071B-0.027C+0.1D-0.11AB-0.18AC+0.28AD+2.500E-003BC-0.063BD-0.047CD-0.31A2-0.38B2-0.32C2-0.56D2，方差分析結果見表3。

表3 實驗結果分析[14]Table 3 Analysis of experimental results

由表3可知，回歸方程的F值為 33.59，平方和為 3.74，自由度為14，均方為0.27，其顯著水平P<0.01，說明該模型非常顯著。

由表3還可知，A、AD、A2、B2、C2、D2對柴胡總皂苷得率的影響較大，達到極顯著水平(P<0.01)，B、D、AB、AC達到顯著水平(P<0.05)，因素C(P=0.313 3>0.05)不顯著。

2.6.2 響應曲面分析 將提取時間、提取溫度、乙醇濃度、料液比中任意兩個因素設為定值時，分析另外兩個因素間的交互作用及對總皂苷得率的影響[15]，結果見圖7。

圖7 各因素交互作用的響應曲面圖Fig.7 Response surface of interaction of various factors

2.6.3 工藝條件優化 通過優化得到的工藝參數：乙醇濃度68.6%，溫度60.58 ℃，提取時間 149.78 min，料液比1∶19.61 g/mL，總皂苷得率3.02%。為簡化工業化的操作，將工藝參數調整為：乙醇濃度69%，溫度61 ℃，提取時間150 min，料液比1∶20 g/mL，并在該條件下進行驗證實驗，重復3次，總皂苷平均得率3.12%，理論值與預測值相差0.1%。說明該工藝參數可靠。

3 結論

用乙醇提取柴胡總皂苷的最佳工藝參數為：乙醇濃度69%，提取溫度61 ℃，提取時間150 min，提取料液比1∶20 g/mL。在該條件下，柴胡總皂苷的提取率3.12%。